【摘要】：目的:建立急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)大鼠模型,叔丁基對(duì)苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)干預(yù)該模型,進(jìn)行行為學(xué)病理學(xué)觀察,檢測(cè)腦海馬區(qū)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)及醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表達(dá)及相關(guān)性分析,探討上述兩種蛋白潛在的病理生理機(jī)制,為DEACMP發(fā)病機(jī)制的研究及疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。方法:1、選取180只正常清潔級(jí)健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,隨機(jī)抽取120只用首劑+追加多次腹腔注射一氧化碳(carbon monoxide,CO)法建立DEACMP模型,余60只用同等方式方法注射空氣作為空氣對(duì)照組(AC組)。將DEACMP大鼠隨機(jī)分為單純一氧化碳中毒組(CO組)、一氧化碳中毒+tBHQ組(TC組)各60只,各組按染毒后1、3、7、14、21、28d作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)分為6個(gè)亞組,每個(gè)亞組10只。染毒后TC組予以每日一次腹腔注射tBHQ,AC組、CO組不做其他處理,實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水。2、股動(dòng)脈取血監(jiān)測(cè)碳氧血紅蛋白(HbCO)濃度,Morris水迷宮(morris water maze,MWM)實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠染毒前與染毒后的學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能改變,驗(yàn)證是否造模成功及觀察大鼠認(rèn)知功能改變程度;HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞的病理學(xué)改變;Tunel染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡情況;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達(dá),整個(gè)海馬的NQO1表達(dá)用免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)。3、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果:1、成功建立大鼠DEACMP模型:(1)CO組、TC組大鼠中毒后不久即發(fā)生呼吸加速、活動(dòng)減少、肢體乏力、精神萎靡癥狀,隨著染毒次數(shù)增多一些大鼠發(fā)生大小便失禁、四肢強(qiáng)直抽搐,甚至喪失意識(shí)、死亡。存活的中毒大鼠表現(xiàn)出活動(dòng)減少、煩躁不安、食欲減退等現(xiàn)象,AC組大鼠無(wú)明顯變化;(2)Hb CO濃度監(jiān)測(cè):CO組、TC組大鼠股動(dòng)脈血HbCO濃度50%,且維持時(shí)長(zhǎng)16h;(3)MWM實(shí)驗(yàn):在染毒前和染毒后7d三組大鼠的平均逃避潛伏期、平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間/總時(shí)間的百分比差異在組間及組內(nèi)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與AC組相比,在染毒后14d、21d、28d,CO組、TC組大鼠平均逃避潛伏期延長(zhǎng)、平臺(tái)象限活動(dòng)時(shí)間/總時(shí)間的百分比縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與CO組相比,在染毒后21d、28d,TC組上述改變更明顯(P0.05);(4)HE染色:AC組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞無(wú)明顯異常,CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的病理改變,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞數(shù)量變少,間隙增大,細(xì)胞水腫,細(xì)胞核固縮、碎裂,細(xì)胞變性、壞死等。2、Tunel染色:AC組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡不明顯,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)中CO組、TC組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P0.05),呈升高-高峰(7d)-下降的走勢(shì)。與CO組相比,在染毒后1d、3d、7d,TC組細(xì)胞凋亡降低(P0.05),在染毒后21d、28d,TC組細(xì)胞凋亡增加(P0.05)。3、Nrf2及NQO1蛋白的表達(dá):(1)免疫組織化學(xué)法:AC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達(dá)極少,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)中CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達(dá)均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-下降的走勢(shì),各監(jiān)測(cè)點(diǎn)中TC組均高于CO組(P0.05);(2)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)表達(dá)趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果基本一致:AC組大鼠海馬NQO1表達(dá)量較少,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)無(wú)明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測(cè)點(diǎn)中CO組、TC組大鼠海馬NQO1/β-actin密度相對(duì)值均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-降低的走勢(shì),各監(jiān)測(cè)點(diǎn)中TC組均高于CO組(P0.05)。結(jié)論:1、首劑+追加的多次腹腔注射CO法是創(chuàng)建DEACMP模型的理想方法,具有操作簡(jiǎn)單、儀器常規(guī)、CO使用量少且易控制、安全、不污染環(huán)境、不浪費(fèi)等優(yōu)點(diǎn)。2、通過(guò)MWM實(shí)驗(yàn)比較大鼠染毒前后記憶及認(rèn)知功能的變化,監(jiān)測(cè)中毒大鼠動(dòng)脈血HbCO濃度變化,結(jié)合中毒大鼠海馬組織細(xì)胞的病理學(xué)及行為變化可初步判定是否成功建立DEACMP大鼠模型及大鼠高級(jí)認(rèn)知功能損傷程度。3、tBHQ在遲發(fā)性腦病大鼠模型中能促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位增加其表達(dá)從而上調(diào)下游靶蛋白NQO1的表達(dá),前期(≤3d)表達(dá)升高發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用,后期(14d,21d,28d)兩者持續(xù)過(guò)表達(dá)促進(jìn)大鼠海馬細(xì)胞發(fā)生遲發(fā)性凋亡,證明Nrf2/NQO1通路可能參與大鼠急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R595.1;R747.9
【圖文】：

結(jié) 果1 基本行為學(xué)改變讓染毒后的大鼠在室溫下空氣流通處自由攝食飲水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及時(shí)用備用鼠補(bǔ)足。解剖死鼠后可觀察到充血水腫、顏色暗紅甚至表面有小出血點(diǎn)的肝腸等臟器(見(jiàn)圖 1-4)，與 AC 組相比存活的染毒大鼠攝食減少，精神欠佳，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍。而AC 組大鼠染毒前后行為無(wú)明顯變化。

結(jié) 果1 基本行為學(xué)改變讓染毒后的大鼠在室溫下空氣流通處自由攝食飲水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及時(shí)用備用鼠補(bǔ)足。解剖死鼠后可觀察到充血水腫、顏色暗紅甚至表面有小出血點(diǎn)的肝腸等臟器(見(jiàn)圖 1-4)，與 AC 組相比存活的染毒大鼠攝食減少，精神欠佳，活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍。而AC 組大鼠染毒前后行為無(wú)明顯變化。

圖 1-2 染毒大鼠肢端口唇出現(xiàn)櫻桃紅Fig.1-2 Limbs far and lips cherry redof rats after poisoning圖 1-4 染毒大鼠腹腔臟器充血水腫Fig.1-4 Abdominal viscera hyperemia edemof rats after poisoning2 染毒前后大鼠動(dòng)脈血 HbCO 濃度動(dòng)態(tài)改變用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行三組大鼠股動(dòng)脈血的 HbCO 濃度檢測(cè)，結(jié)果示三組大鼠 HbCO 濃度在染毒前均＜1%，初次染毒后 15min 大鼠脈血 HbCO 濃度攀升達(dá) 65%以上，而后呈現(xiàn)逐步下降走勢(shì)，但在毒 2h 時(shí)仍高于 60%，4h 時(shí)降至 55%左右，此時(shí)追加半劑 CO 注射毒后測(cè) HbCO 濃度繼續(xù)攀升至 70%左右，而后再次出現(xiàn)下降走勢(shì)

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本文編號(hào)：2766365