【摘要】：目的:建立急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)大鼠模型,叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)干預該模型,進行行為學病理學觀察,檢測腦海馬區(qū)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)及醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表達及相關(guān)性分析,探討上述兩種蛋白潛在的病理生理機制,為DEACMP發(fā)病機制的研究及疾病的治療提供實驗依據(jù)和參考。方法:1、選取180只正常清潔級健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,隨機抽取120只用首劑+追加多次腹腔注射一氧化碳(carbon monoxide,CO)法建立DEACMP模型,余60只用同等方式方法注射空氣作為空氣對照組(AC組)。將DEACMP大鼠隨機分為單純一氧化碳中毒組(CO組)、一氧化碳中毒+tBHQ組(TC組)各60只,各組按染毒后1、3、7、14、21、28d作為監(jiān)測點分為6個亞組,每個亞組10只。染毒后TC組予以每日一次腹腔注射tBHQ,AC組、CO組不做其他處理,實驗期間大鼠自由攝食飲水。2、股動脈取血監(jiān)測碳氧血紅蛋白(HbCO)濃度,Morris水迷宮(morris water maze,MWM)實驗測試大鼠染毒前與染毒后的學習記憶認知功能改變,驗證是否造模成功及觀察大鼠認知功能改變程度;HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)細胞的病理學改變;Tunel染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡情況;免疫組織化學法檢測大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達,整個海馬的NQO1表達用免疫印跡試驗(Western Blot)檢測。3、均數(shù)±標準差表示實驗數(shù)據(jù),用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果:1、成功建立大鼠DEACMP模型:(1)CO組、TC組大鼠中毒后不久即發(fā)生呼吸加速、活動減少、肢體乏力、精神萎靡癥狀,隨著染毒次數(shù)增多一些大鼠發(fā)生大小便失禁、四肢強直抽搐,甚至喪失意識、死亡。存活的中毒大鼠表現(xiàn)出活動減少、煩躁不安、食欲減退等現(xiàn)象,AC組大鼠無明顯變化;(2)Hb CO濃度監(jiān)測:CO組、TC組大鼠股動脈血HbCO濃度50%,且維持時長16h;(3)MWM實驗:在染毒前和染毒后7d三組大鼠的平均逃避潛伏期、平臺象限活動時間/總時間的百分比差異在組間及組內(nèi)比較均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與AC組相比,在染毒后14d、21d、28d,CO組、TC組大鼠平均逃避潛伏期延長、平臺象限活動時間/總時間的百分比縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與CO組相比,在染毒后21d、28d,TC組上述改變更明顯(P0.05);(4)HE染色:AC組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞無明顯異常,CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞均出現(xiàn)不同程度的病理改變,細胞排列紊亂,細胞數(shù)量變少,間隙增大,細胞水腫,細胞核固縮、碎裂,細胞變性、壞死等。2、Tunel染色:AC組大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡不明顯,各監(jiān)測點無明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測點中CO組、TC組細胞凋亡指數(shù)明顯增加(P0.05),呈升高-高峰(7d)-下降的走勢。與CO組相比,在染毒后1d、3d、7d,TC組細胞凋亡降低(P0.05),在染毒后21d、28d,TC組細胞凋亡增加(P0.05)。3、Nrf2及NQO1蛋白的表達:(1)免疫組織化學法:AC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達極少,各監(jiān)測點無明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測點中CO組、TC組大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2及NQO1的表達均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-下降的走勢,各監(jiān)測點中TC組均高于CO組(P0.05);(2)免疫印跡試驗(Western Blot)表達趨勢與免疫組化結(jié)果基本一致:AC組大鼠海馬NQO1表達量較少,各監(jiān)測點無明顯差異(P0.05)。與AC組相比,各監(jiān)測點中CO組、TC組大鼠海馬NQO1/β-actin密度相對值均升高(P0.05),呈升高-高峰(3d)-降低的走勢,各監(jiān)測點中TC組均高于CO組(P0.05)。結(jié)論:1、首劑+追加的多次腹腔注射CO法是創(chuàng)建DEACMP模型的理想方法,具有操作簡單、儀器常規(guī)、CO使用量少且易控制、安全、不污染環(huán)境、不浪費等優(yōu)點。2、通過MWM實驗比較大鼠染毒前后記憶及認知功能的變化,監(jiān)測中毒大鼠動脈血HbCO濃度變化,結(jié)合中毒大鼠海馬組織細胞的病理學及行為變化可初步判定是否成功建立DEACMP大鼠模型及大鼠高級認知功能損傷程度。3、tBHQ在遲發(fā)性腦病大鼠模型中能促進Nrf2核轉(zhuǎn)位增加其表達從而上調(diào)下游靶蛋白NQO1的表達,前期(≤3d)表達升高發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用,后期(14d,21d,28d)兩者持續(xù)過表達促進大鼠海馬細胞發(fā)生遲發(fā)性凋亡,證明Nrf2/NQO1通路可能參與大鼠急性一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病的發(fā)生。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R595.1;R747.9
【圖文】：

結(jié) 果1 基本行為學改變讓染毒后的大鼠在室溫下空氣流通處自由攝食飲水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及時用備用鼠補足。解剖死鼠后可觀察到充血水腫、顏色暗紅甚至表面有小出血點的肝腸等臟器(見圖 1-4)，與 AC 組相比存活的染毒大鼠攝食減少，精神欠佳，活動減少，反應(yīng)遲鈍。而AC 組大鼠染毒前后行為無明顯變化。

結(jié) 果1 基本行為學改變讓染毒后的大鼠在室溫下空氣流通處自由攝食飲水，所有大鼠染毒全程死亡 8 只，及時用備用鼠補足。解剖死鼠后可觀察到充血水腫、顏色暗紅甚至表面有小出血點的肝腸等臟器(見圖 1-4)，與 AC 組相比存活的染毒大鼠攝食減少，精神欠佳，活動減少，反應(yīng)遲鈍。而AC 組大鼠染毒前后行為無明顯變化。

圖 1-2 染毒大鼠肢端口唇出現(xiàn)櫻桃紅Fig.1-2 Limbs far and lips cherry redof rats after poisoning圖 1-4 染毒大鼠腹腔臟器充血水腫Fig.1-4 Abdominal viscera hyperemia edemof rats after poisoning2 染毒前后大鼠動脈血 HbCO 濃度動態(tài)改變用血氣分析儀進行三組大鼠股動脈血的 HbCO 濃度檢測，結(jié)果示三組大鼠 HbCO 濃度在染毒前均＜1%，初次染毒后 15min 大鼠脈血 HbCO 濃度攀升達 65%以上，而后呈現(xiàn)逐步下降走勢，但在毒 2h 時仍高于 60%，4h 時降至 55%左右，此時追加半劑 CO 注射毒后測 HbCO 濃度繼續(xù)攀升至 70%左右，而后再次出現(xiàn)下降走勢

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本文編號：2766365