【摘要】：背景:氯吡格雷治療后高血小板反應性系多重因素共同作用的結(jié)果,明確氯吡格雷治療后血小板反應性的調(diào)控機制,對于評估藥物療效、做好個體化精準治療具有十分重要的意義。多項研究均證實miR-223在氯吡格雷治療后高血小板反應性的發(fā)生中可能起到一定的作用,但是其具體的機制尚不清楚,有待更為深入的研究。然而生物信息學分析顯示小鼠中miR-223與P2Y12可能并不存在靶向調(diào)控關系,這使得動物水平上對于miR-223的研究受到了極大的限制。不僅如此,研究還面臨著氯吡格雷作為前體藥物需要肝藥酶代謝活化才能產(chǎn)生具有藥理活性的代謝產(chǎn)物,以及作為藥物靶標的血小板為無核終末細胞不能進行長期培養(yǎng)等等技術(shù)難題,這些都在某種程度上進一步限制了研究的推進。本研究通過建立氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞的實驗模型,使得氯吡格雷可以直接在體外完成代謝活化并進行細胞實驗,并利用該細胞模型相關實驗與相關臨床研究,對氯吡格雷治療低反應的機制的進行了更深一步的探討。本研究共分為三個部分。第一部分MicroRNA-223與急性缺血性卒中患者血小板ADP受體P2Y12和氯吡格雷反應性的相關性分析目的:探討急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療前后血小板膜蛋白P2Y12表達水平與血小板反應性的關系,以及miR-223在其中的調(diào)控作用。方法:采用流式細胞術(shù)檢測急性缺血性卒中患者治療前后ADP誘導血小板聚集率,通過血小板相對抑制率及八分位數(shù)法篩選出低反應組和高反應組,檢測極端病例治療前后血小板中P2Y12蛋白表達水平,并比較分析其在兩組極端病例中的差異;構(gòu)建病毒載體感染人成巨核細胞白血病細胞MEG-01,下調(diào)miR-223水平,觀察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表達變化。結(jié)果:在急性缺血性卒中患者中,無論在治療前水平還是治療后水平,血小板P2Y12的蛋白表達水平與血小板聚集率均呈顯著正相關(p0.05)。高反應組治療后較治療前P2Y12蛋白表達水平有所降低,但無統(tǒng)計學意義(p=0.073)。低反應組治療前后血小板P2Y12蛋白表達的改變程度較高反應組顯著減低(1.14604 vs 0.77097,p=0.031)。通過構(gòu)建病毒載體感染下調(diào)MEG-01細胞中miR-223水平,可以顯著升高P2Y12 mRNA水平和蛋白水平的表達。結(jié)論:氯吡格雷低反應組治療前后血小板P2Y12蛋白表達的相對降低程度較高反應組顯著減低;在人血小板前體細胞中,miR-223可以調(diào)控ADP受體蛋白P2Y12的表達。第二部分氯吡格雷肝微粒體孵育液處理人成巨核細胞白血病細胞模型的建立及其對miR-223表達的影響目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液處理人成巨核細胞白血病細胞MEG-01的細胞處理模型,并探討氯吡格雷孵育液處理對miR-223表達所產(chǎn)生的影響,為從細胞水平探索氯吡格雷治療對人體血小板所產(chǎn)生影響提供新的方法學依據(jù)。方法:利用毒理學研究方法,以肝微粒體和氯吡格雷在適宜體系條件下共同孵育,獲得含有氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的孵育液。觀察不同濃度梯度和不同時間節(jié)點氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞后P2Y12蛋白水平的表達變化,確定細胞模型最佳處理濃度和時間,觀察細胞中miR-223表達變化。結(jié)果:在低(100ul/2ml)、高(200ul/2ml)兩種濃度下氯吡格雷孵育液處理MEG-01細胞后,P2Y12蛋白表達均無顯著變化(p0.05)。在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天的條件下,氯吡格雷孵育液組細胞膜P2Y12蛋白表達較對照肝微粒體孵育液組顯著降低42.6%(p0.01)。在以200ul/2ml的濃度分別連續(xù)處理3天、5天后,氯吡格雷孵育液處理的MEG-01細胞中miR-223表達分別下降了47.3%和32%(p值均0.05)。結(jié)論:在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理3-5天的條件下,氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞可以簡單模擬氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物對巨核細胞和血小板產(chǎn)生作用的過程;用氯吡格雷藥物治療3天以上時,miR-223表達水平會顯著降低。第三部分氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物通過P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223通路削弱其本身的P2Y12拮抗劑效應目的:探討氯吡格雷孵育液處理細胞對C/EBPα表達所產(chǎn)生的影響,以及C/EBPα在氯吡格雷治療后血小板反應性調(diào)控機制中所起的作用。方法:觀察氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞后C/EBPα表達的變化;采用LY294002抑制劑處理MEG-01細胞選擇性抑制PI3K通路,觀察下游C/EBPα、miR-223和P2Y12表達的變化。結(jié)果:以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天后,相較于對照肝微粒體孵育液組,氯吡格雷孵育液組細胞膜蛋白P2Y12及轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的蛋白表達水平均顯著降低(p值均0.01)。連續(xù)處理3天或5天后,氯吡格雷孵育液組細胞C/EBPαmRNA表達均顯著降低(p值均0.01)。P2Y12 mRNA表達在連續(xù)處理3天時升高193.4%(p0.001),在連續(xù)處理5天時則顯著降低(p0.05,見圖)。LY294002處理7天后,MEG-01細胞中PI3K/Akt通路活性被顯著抑制,p-Akt蛋白表達水平顯著降低,且與抑制劑濃度相關(p值均0.05)。轉(zhuǎn)錄因子C/EBPαmRNA及蛋白表達水平均顯著降低,但蛋白水平與抑制劑濃度無明顯相關。結(jié)論:氯吡格雷肝微粒體孵育液處理后,細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達會顯著降低,并通過P2Y12-PI3K/Akt-C/EBPα-miR-223環(huán)路對P2Y12通路的抑制進行負反饋調(diào)節(jié)。該負反饋調(diào)節(jié)環(huán)路的過度激活,可能與氯吡格雷治療低反應的發(fā)生相關。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3
【圖文】：

圖 1.1 流式檢測 ADP 誘導的血小板聚集率吡格雷治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達的變化篩選出的極端病例治療前后血樣分別進行磁珠分選純化血小板并白，以 Western blot 檢測血小板膜蛋白 P2Y12 相對表達水平。相關不論在治療前還是治療后水平，血小板 P2Y12 蛋白表達水平均與呈正相關（治療前 r=0.814，圖 1.2 A；治療后 r=0.879，圖 1.2 B。治療前后兩組極端病例血小板 P2Y12 蛋白相對表達量分布如圖。與血小板反應性類似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表達水平在個變異。無論在治療前水平還是治療后水平，LR 組與 HR 組相比 蛋白表達水平均無顯著差異。對每例患者治療前后的血小板蛋白比較可以發(fā)現(xiàn)，LR 組治療后與治療前相比無顯著變化，而 HR 組前 P2Y12 蛋白表達水平有所降低，但無統(tǒng)計學意義（p=0.073，圖據(jù)上述結(jié)果推測，LR 組與 HR 組在治療前后血小板 P2Y12 蛋白表上可能存在差異。據(jù)此，本研究對每例患者進行了治療前后蛋白的計算。定義治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達比值 R=治療后

p 值均<0.01）。治療前后兩組極端病例血小板 P2Y12 蛋白相對表達量分布如圖所示（圖1.2 C）。與血小板反應性類似，患者血小板膜蛋白 P2Y12 表達水平在個體間存在較大變異。無論在治療前水平還是治療后水平，LR 組與 HR 組相比血小板P2Y12 蛋白表達水平均無顯著差異。對每例患者治療前后的血小板蛋白表達水平進行比較可以發(fā)現(xiàn)，LR 組治療后與治療前相比無顯著變化，而 HR 組治療后較治療前 P2Y12 蛋白表達水平有所降低，但無統(tǒng)計學意義（p=0.073，圖 1.2 D）。根據(jù)上述結(jié)果推測，LR 組與 HR 組在治療前后血小板 P2Y12 蛋白表達的變化程度上可能存在差異。據(jù)此

26圖 1.3 microRNA-223 對血小板膜蛋白 P2Y12 的調(diào)控作用1.3 討論1.3.1 氯吡格雷治療后低反應的定義與檢測方法抗血小板藥物低反應，過去更多被稱為抗血小板藥物抵抗，可分為臨床抵抗和實驗室抵抗。前者是指患者服用標準劑量的抗血小板藥物卻不能有效避免或減少缺血性事件的再發(fā)，實驗室抵抗是指抗血小板藥物不能有效抑制血小板聚集，通過檢測發(fā)現(xiàn)血小板聚集率等反應血小板功能和活化的指標在治療后未能產(chǎn)生預期效果。通常研究中噻酚吡啶類藥物的實驗室抵抗是指阻斷 P2Y12 受體信號轉(zhuǎn)導后并未起到抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)介導的血小板聚集效應[23]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

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本文編號：2765001