【摘要】：周圍性面癱(peripheral facial paralysis)是臨床常見病、多發(fā)病,可由病毒感染、創(chuàng)傷、壓迫、手術(shù)等多種因素引起,其中外傷是導(dǎo)致面神經(jīng)損傷(facial nerve injury)的重要原因之一。由于面部表情是一種十分重要的非語言交往手段,面癱的出現(xiàn)對(duì)患者的正常交流造成影響,不僅明顯降低患者生活質(zhì)量、影響學(xué)習(xí)以及工作,嚴(yán)重者甚至損害患者心理健康。關(guān)于面神經(jīng)損傷后病理生理機(jī)制尚不明確,近年來越來越多研究已經(jīng)證實(shí),面神經(jīng)損傷后不僅面神經(jīng)纖維本身出現(xiàn)退行性改變,中樞端的神經(jīng)元胞體也會(huì)發(fā)生凋亡,這主要是由軸突逆行性變性引發(fā)的程序性凋亡反應(yīng)引起的,進(jìn)而影響面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。盡管相繼發(fā)現(xiàn)大量信號(hào)通路、基因與神經(jīng)再生、修復(fù)相關(guān),但其具體分子機(jī)制并不十分清楚。目前臨床上多采用神經(jīng)吻合、神經(jīng)移植、神經(jīng)導(dǎo)管等技術(shù)恢復(fù)神經(jīng)的完整性,還可局部給予營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)神經(jīng)纖維再生及功能恢復(fù)的治療方法,如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞、電刺激治療等;雖然這些神經(jīng)因子與組織工程等治療性研究被越來越多應(yīng)用于臨床中,但目前并無客觀可靠的臨床及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。因此,闡明面神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生與修復(fù)的病理生理機(jī)制,進(jìn)一步探討如何促進(jìn)神經(jīng)纖維再生及減少神經(jīng)元胞體死亡成為治療面神經(jīng)損傷的重要研究方向。但由于以上這些治療方法僅僅針對(duì)受損神經(jīng)纖維局部進(jìn)行修復(fù),并不能直接作用于位于中樞的神經(jīng)元胞體,而且這些因子多屬于大分子多肽類物質(zhì),不易通過血腦屏障到達(dá)受損神經(jīng)元,且如果長(zhǎng)時(shí)間大劑量全身用藥,往往可能引起明顯的毒副作用。因此,尋找一種能快速穿透血腦屏障、直接保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)纖維再生的小分子藥物已成為近年來眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)之一。丙戊酸(valproic acid,VPA)是臨床上常用的一種廣譜抗癲癇、抗驚厥藥物,屬小分子短鏈脂肪酸,能夠迅速透過大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞直接作用于中樞神經(jīng)元,已在臨床應(yīng)用40余年,其安全性、有效性已得到證實(shí)。VPA主要通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)來發(fā)揮其藥理作用,可通過阻斷電壓敏感性Na+通道和Ca2+通道,進(jìn)而限制神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢活l率;并能通過抑制γ-氨基丁酸(GABA)代謝酶,增加腦內(nèi)GABA的合成與釋放,降低神經(jīng)元興奮性、抑制神經(jīng)元過度放電以及異常放電的擴(kuò)散;還可通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)來降低谷氨酸能神經(jīng)的興奮性�；赩PA的這些藥理作用,近年來越來越多的學(xué)者將其應(yīng)用于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)中來。研究發(fā)現(xiàn),體外細(xì)胞培養(yǎng)中,VPA可抑制細(xì)胞凋亡,不僅能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元,還可抑制其分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,中樞及周圍神經(jīng)損傷后VPA具有激活轉(zhuǎn)錄、增強(qiáng)基因表達(dá)、調(diào)控靶蛋白,進(jìn)而發(fā)揮抑制凋亡、保護(hù)神經(jīng)元存活、促進(jìn)神經(jīng)軸突再生及神經(jīng)干細(xì)胞遷移及分化、抑制炎癥反應(yīng)、減少膠質(zhì)細(xì)胞增生等作用。但目前尚未有關(guān)于VPA對(duì)面神經(jīng)損傷導(dǎo)致的周圍性面癱的是否有保護(hù)作用的相關(guān)研究。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過橫斷顳骨外段面神經(jīng)總干建立外傷性周圍性面癱的動(dòng)物模型,采用Nissl染色、TUNEL染色、免疫熒光及Western blot技術(shù)對(duì)面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)功能、面神經(jīng)元形態(tài)、凋亡情況、相關(guān)因子表達(dá)情況進(jìn)行觀察,探討這些因子對(duì)面神經(jīng)損傷后神經(jīng)元存活、面神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,并進(jìn)一步研究損傷后給予VPA治療對(duì)面神經(jīng)元是否具有神經(jīng)保護(hù)作用,以及可能與此相關(guān)的分子機(jī)制,為臨床上促進(jìn)面神經(jīng)再生與修復(fù)、功能恢復(fù)的治療方法提供理論依據(jù)。目的1.建立顳骨外段面神經(jīng)干橫斷傷動(dòng)物模型,并評(píng)估損傷后不同時(shí)間點(diǎn)面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。2.評(píng)估面神經(jīng)總干損傷后面神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量變化、凋亡情況及相關(guān)因子(Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43)蛋白表達(dá)水平的變化。3.探討VPA對(duì)面神經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制。方法1.150只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為3組,雌雄不分�？瞻讓�(duì)照組(Sham組)僅解剖暴露顳骨外段面神經(jīng)總干,不做切斷處理。通過切斷右側(cè)莖乳孔外0.5cm顳骨外段面神經(jīng)總干建立大鼠面神經(jīng)橫斷傷模型,依據(jù)是否使用VPA將剩余兩組大鼠分為單純損傷組(NS組)、丙戊酸組(VPA組)。其中,NS組大鼠每日喂食生理鹽水,VPA組大鼠則給予喂食等量的含有VPA(300 mg/kg)的生理鹽水。2.術(shù)后每天觀察大鼠損傷側(cè)的瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)及鼻尖位置,并進(jìn)行評(píng)分,依據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來判斷面神經(jīng)功能變化情況。3.三組大鼠分別在術(shù)后第1、7、14、21、28天的同一時(shí)間內(nèi)處死,并依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜留取含面神經(jīng)核的腦干組織制作冰凍切片,留取面神經(jīng)核組織提取蛋白以進(jìn)行下一步的免疫熒光及Western blot檢測(cè)。4.運(yùn)用Nissl染色法,觀察三組面神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元胞體形態(tài)及存活數(shù)量情況,TUNEL染色觀察發(fā)生凋亡的面神經(jīng)元。5.運(yùn)用免疫熒光和Western blot檢測(cè),從蛋白水平上檢測(cè)各組大鼠面神經(jīng)核內(nèi)Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43 表達(dá)含量的變化。結(jié)果1.面神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)果顯示,面神經(jīng)干切斷后大鼠出現(xiàn)患側(cè)完全性面癱,即瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)消失,鼻尖偏向健側(cè);NS組大鼠面神經(jīng)功能隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)逐漸出現(xiàn)面部運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù),術(shù)后第28天可見明顯瞬目反射及輕微觸須運(yùn)動(dòng),與第7天相比,具有顯著差異(p0.05),但仍較健側(cè)面神經(jīng)功能減低。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VPA組大鼠的面神經(jīng)功能評(píng)分均明顯高于NS組,差異具有顯著性(p0.05)。Sham組大鼠假損傷側(cè)面神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)功能與健側(cè)相比并無明顯異常。2.Nissl染色結(jié)果顯示,NS組大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)元存活率隨著時(shí)間逐漸下降,術(shù)后 1、7、14、21、28 天分別為 92.95±2.99%、75.21±6.25%、70.30±2.25%、68.30±3.35%、69.38±3.30%,VPA 組面神經(jīng)元存活率分別為 94.44±5.70%、80.46±3.99%、85.34±0.59%、86.33±1.83%、86.98± 1.76%。由此可見,VPA組大鼠面神經(jīng)元存活率與NS組比較明顯提高,差異具有顯著性(p0.05)。NS組中面神經(jīng)元在神經(jīng)損傷后第14天形態(tài)變化最明顯,出現(xiàn)胞體萎縮,尼氏體數(shù)量明顯減少而且模糊不清,典型者可見到凋亡小體,胞核逐漸固縮并移至靠近細(xì)胞膜,嚴(yán)重者胞核完全消失,樹突也可見到部分消失;而VPA組大鼠面神經(jīng)核內(nèi)異常形態(tài)的神經(jīng)元數(shù)量在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與NS組相比較則明顯減少。3.TUNEL染色結(jié)果顯示,凋亡面神經(jīng)元胞核標(biāo)記為紅色。術(shù)后第1、7、14、21、28天時(shí),Sham組大鼠面神經(jīng)核內(nèi)并未見到TUNEL陽性神經(jīng)元,同樣,術(shù)后第1天時(shí)NS組及VPA組大鼠亦未見到TUNEL陽性細(xì)胞;而到了術(shù)后第7天時(shí),NS組面神經(jīng)元開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,術(shù)后第14天時(shí)達(dá)到峰值,隨后凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸減少,到第28天時(shí)仍可見到TUNEL陽性細(xì)胞;術(shù)后第7、14、21、28 天 NS 組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為 10.7±2.96、15.7±1.45、12.3±1.20、9.0±0.58,而VPA組中第7、14、21、28天凋亡細(xì)胞數(shù)分別為8.0± 1.53、7.0±0.58、5.3±0.88、5.7±0.79。由上可見,與NS組比較,VPA組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)其面神經(jīng)核內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)均有明顯下降,差異具有顯著性(p0.05)。4.免疫熒光結(jié)果顯示,Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43均表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi),而胞核內(nèi)無明顯表達(dá)。Sham組中,上述各因子熒光表達(dá)均較微弱;而NS組中,Bax蛋白表達(dá)在面神經(jīng)損傷后逐漸增強(qiáng),到術(shù)后第14天達(dá)到峰值,隨后逐漸減弱,至第28天時(shí)熒光表達(dá)仍較強(qiáng);VPA組中,該蛋白在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光表達(dá)均明顯弱于NS組,但仍較Sham組增強(qiáng)。NS組中,面神經(jīng)損傷后cleaved caspase-3蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng),同樣在術(shù)后第14天達(dá)到峰值,隨后其表達(dá)減弱,至第28天時(shí)仍有較強(qiáng)熒光表達(dá);而VPA組中cleaved caspase-3蛋白的熒光表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均較NS組明顯減弱,但仍較Sham組增強(qiáng)。NS組中,面神經(jīng)核內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)在面神經(jīng)損傷后亦逐漸增強(qiáng),到術(shù)后第14天達(dá)到峰值,隨后逐漸減弱,至第28天時(shí)仍有較強(qiáng)表達(dá);而VPA組BDNF蛋白在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光表達(dá)較NS組及Sham組均有所增強(qiáng)。NS組中,面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內(nèi)GAP-43蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng),到術(shù)后第14天達(dá)到峰值,后漸減弱,至第28天時(shí)仍有較強(qiáng)表達(dá),VPA組GAP-43蛋白熒光表達(dá)均明顯強(qiáng)于NS組及Sham組。5.Western blot結(jié)果顯示,面神經(jīng)損傷后NS組面神經(jīng)核內(nèi)Bax、cleaved caspase-3、BDNF、GAP-43蛋白表達(dá)具有時(shí)間相關(guān)性,即損傷后立即出現(xiàn)蛋白含量增高,到損傷后第14天時(shí)達(dá)高峰,隨后各因子蛋白表達(dá)均有不同程度下降,至第28天時(shí)其含量仍有不同程度增高,這與免疫熒光結(jié)果相一致。與NS 組相比,在損傷后第 1、7、14、21、28 天 VPA 組中 Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)含量均顯著降低,而BDNF、GAP-43蛋白表達(dá)含量則明顯上調(diào),差異具有顯著性(p0.05)。結(jié)論本課題研究結(jié)果表明,面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核團(tuán)神經(jīng)元不僅胞體發(fā)生形態(tài)上的改變,還可出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象,胞體內(nèi)蛋白表達(dá)亦發(fā)生相應(yīng)變化,這些變化可能與面神經(jīng)損傷后面部運(yùn)動(dòng)功能變化相關(guān)。VPA的應(yīng)用對(duì)神經(jīng)損傷引起的面神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象具有抑制作用,可增加其胞體存活數(shù)量,從而促進(jìn)面神經(jīng)元細(xì)胞功能及面部運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。VPA對(duì)神經(jīng)元的這種保護(hù)作用可能是通過抑制凋亡相關(guān)因子(Bax、cleaved caspase-3)、增加促進(jìn)神經(jīng)元存活的因子(BDNF、GAP-43)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R745.12
【圖文】：

逡逑大鼠行為學(xué)觀察包括：瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)及鼻尖位置（圖２）。逡逑ｍｍｍｍｍ邐ｉ逡逑正常大鼠邐面神經(jīng)損傷后大鼠逡逑圖２大鼠面神經(jīng)損傷前及損傷后面部運(yùn)動(dòng)功能逡逑評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：逡逑（１）

１．邋ＶＰＡ可促進(jìn)面神經(jīng)損傷后面部運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。逡逑術(shù)后每天觀察大鼠面神經(jīng)功能并進(jìn)行評(píng)估直到術(shù)后第２８天。功能評(píng)分包括：逡逑瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)以及鼻尖位置。從圖３我們可以看出，面神經(jīng)損傷后大鼠立逡逑即出現(xiàn)患側(cè)完全性面癱，評(píng)分為０，即患側(cè)眼瞼、觸須均無動(dòng)度，鼻尖歪向健側(cè)；逡逑隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠面神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，ＮＳ組大鼠到第１０天左右出現(xiàn)患逡逑側(cè)眼瞼輕微眨眼活動(dòng)，但不能完全閉合，患側(cè)觸須無明顯抖動(dòng)，鼻尖仍偏斜向健逡逑側(cè)，直到第１６天患側(cè)眼瞼動(dòng)度明顯增加，可不完全閉合，功能評(píng)分為１分；而第逡逑２２天后右側(cè)眼瞼幾乎可完全閉合，患側(cè)觸須輕微抖動(dòng)，鼻尖仍歪向健側(cè)，評(píng)分維逡逑持在２分左右。而ＶＰＡ組大鼠面神經(jīng)功能恢復(fù)地更快、更好，術(shù)后第７天即出現(xiàn)患逡逑側(cè)眼瞼活動(dòng)，術(shù)后第１６天患側(cè)眼瞼可完全閉合，觸須出現(xiàn)抖動(dòng)，評(píng)分達(dá)到２分左逡逑右

散在均勻分布，并可延續(xù)到樹突中，可見樹突呈放射狀，形如樹枝，神逡逑經(jīng)元胞膜連續(xù)完整，胞核位于神經(jīng)元胞體中央，大而圓，邊界清楚，核仁明顯可逡逑見（圖４Ａ＆Ｄ）；面神經(jīng)損傷可引起一系列面神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的改變，如ＮＳ組中神逡逑經(jīng)元在神經(jīng)損傷后第１４天出現(xiàn)胞體萎縮，尼氏體數(shù)目減少，模糊不清，甚至可見逡逑到凋亡小體，胞核固縮并移位至細(xì)胞邊緣，嚴(yán)重者胞核消失，神經(jīng)元樹突不明顯逡逑但胞膜完整（圖４Ｂ＆Ｅ）；而ＶＰＡ組與ＮＳ組相比較，在相同時(shí)間點(diǎn)則可見到更逡逑多正常形態(tài)面神經(jīng)元（圖４Ｃ＆Ｆ）。逡逑Ｓｈａｍ邐ＮＳ邐ＶＰＡ逡逑Ａ邐，邋Ｂ邋＇邐、勺？邋ｗ邋＊邋Ｃ邋－邐４０邐．邋＾逡逑廣ｆ邐＾邋ｒ邋■久１ｆｕｗ逡逑聲邋５邋＾邋分人邋４邐。ｔ邋ｕ邋ｉ逡逑旮邋ｆ邐Ｔ．ｖp�？辶x賢跡村澹危椋螅螅烊舊允久嬪窬鶘撕蟮冢保刺烀嬪窬翁峁貢浠義險(xiǎn)Ｃ嬪窬玻�、Ｃ褐G罰�；受所Y嬪窬ǎ擄咨罰�。Ｄ、Qⅲ棋義戲直鷂髯槊嬪窬糯笸枷�。（比例硵]劍保埃郟保保保保╁義仙窬剖峁繽跡鄧荊嬪窬鶘絲梢鵜嬪窬勞觶⒃謁鶘撕簀義系冢保刺熳鈦現(xiàn)兀笠恢背中了鶘撕蟮冢玻柑歟揮耄櫻瑁幔磣橄啾齲危幼樗鶘撕蟮冢卞義咸焐窬壤⑽疵饗韻陸擔(dān)梗玻梗低粒玻梗梗�，所査后第ＹEⅲ保礎(chǔ)ⅲ玻�、２８天分卑捔x銜罰擔(dān)玻

本文編號(hào)：2765088