【摘要】：第一部分ZAG在癲癇患者及癲癇動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)目的:探究ZAG在難治性TLE患者皮質(zhì)及PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠模型海馬、皮質(zhì)組織中的表達(dá)及其表達(dá)變化。方法:1.收集腦外傷患者手術(shù)切除的皮質(zhì)為對(duì)照組(n=20),TLE患者行癲癇灶切除的皮質(zhì)為癲癇組(n=14)。同時(shí),建立PTZ大鼠癲癇模型(n=20),對(duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水(n=20);2.運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)研究顳葉癲癇患者和癲癇大鼠腦組織中ZAG的細(xì)胞定位。運(yùn)用RT-q PCR、免疫組織化學(xué)及Western blot方法測(cè)定癲癇患者和癲癇大鼠腦組織中AZGP1 m RNA和ZAG蛋白表達(dá)量的差異;3.運(yùn)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)PTZ腹腔注射1天、1周、2周、3周和4周的大鼠腦組織中ZAG的蛋白表達(dá)量的變化情況。結(jié)果:1.免疫熒光染色結(jié)果顯示,ZAG主要表達(dá)于人腦組織以及大鼠腦組織中的神經(jīng)元胞質(zhì);2.RT-q PCR結(jié)果顯示癲癇患者及癲癇大鼠腦組織中AZGP1的m RNA水平較對(duì)照組明顯降低(P0.05);3.免疫組織化學(xué)染色和Western blot結(jié)果顯示ZAG在癲癇患者以及癲癇大鼠模型中水平下降(P0.05);4.在癲癇模型大鼠腦組織中的ZAG表達(dá)水平隨PTZ注射時(shí)間的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性加重。結(jié)論:ZAG存在于腦組織中,且其可能是由神經(jīng)元合成,而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。AZGP1 m RNA及ZAG蛋白表達(dá)水平在TLE患者與癲癇大鼠模型腦組織中均下降。癲癇大鼠模型腦組織中ZAG蛋白水平與PTZ注射時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。ZAG的下降可能在癲癇的發(fā)病機(jī)制及病理生理中具有重要作用。第二部分ZAG在癲癇發(fā)作中的作用機(jī)制目的:探索ZAG在癲癇中的可能作用機(jī)制。方法:1.驗(yàn)證AAV的轉(zhuǎn)染效果:將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四個(gè)組(n=20):對(duì)照組(Control)、空病毒組(GFP)、AAV注射后3周組(AZGP1-3W)及、AAV注射后9周組(AZGP1-9W)。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察、RT-q PCR及Western Blot分別檢測(cè)AAV注射后3周及9周的轉(zhuǎn)染效果;2.探索過(guò)表達(dá)AZGP1在PTZ大鼠模型中可能的作用機(jī)制:另取45只SD大鼠隨機(jī)分為三個(gè)組:對(duì)照組(Control)、癲癇組(GFP+PTZ)及過(guò)表達(dá)病毒組(AZGP1+PTZ)。AZGP1+PTZ與GFP+PTZ組大鼠在AAV注射后3周起,每日接受PTZ腹腔注射共28天,Control組大鼠接受同等劑量的生理鹽水腹腔注射。觀察各組大鼠的行為學(xué)及腦電圖(EEG)差異。運(yùn)用Co-IP檢測(cè)癲癇組大鼠腦組織中ZAG與p-ERK及ZAG與TGFβ之間是否存在相互結(jié)合。運(yùn)用Western Blot檢測(cè)各組之間大鼠腦組織中炎癥因子TNFα,IL-6,TGFβ,ERK及p-ERK的表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.AAV-AZGP1和AAV-GFP海馬立體定位注射后,綠色熒光結(jié)果顯示海馬CA3區(qū)有GFP陽(yáng)性表達(dá)。RT-qPCR及免疫印跡及結(jié)果顯示,與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比,AZGP1過(guò)表達(dá)組AZGP1 m RNA及ZAG蛋白在病毒注射后第3周和第9周顯著增加(P0.05);2.Co-IP結(jié)果顯示ZAG可以與p-ERK及TGFβ結(jié)合;3.過(guò)表達(dá)AZGP1可以降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型的癲癇發(fā)作評(píng)分,延長(zhǎng)PTZ點(diǎn)燃的潛伏期,并緩解癲癇樣放電的程度;4.過(guò)表達(dá)AZGP1可以減輕PTZ癲癇模型大鼠的腦組織中TNFα,IL-6,TGFβ水平的升高,并降低ERK的磷酸化水平。結(jié)論:ZAG可能通過(guò)與TGFβ及p ERK之間的相互作用參與癲癇發(fā)生。ZAG可能通過(guò)抑制TGFβ介導(dǎo)的ERK磷酸化以及TNFα和IL-6介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥從而抑制癲癇發(fā)作。ZAG可能是治療癲癇的潛在新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1.1)。圖 1.1 通過(guò) RT-qPCR 檢測(cè) AZGP1 的 mRNA 在 TLE 患者和 PTZ 點(diǎn)燃大鼠的腦組織中的表達(dá)水平，GAPDH 作為內(nèi)參基因。(A）RT-qPCR 結(jié)果顯示 TLE 患者顳皮質(zhì)中 AZGP1 mRNA 水平較對(duì)照組明顯減低

28圖 1.2 免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè) ZAG 的細(xì)胞表達(dá)定位。(A) TLE 患者的顳葉皮質(zhì)中存在 ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞。在顳葉皮質(zhì)中，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物 MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。(B) PTZ 點(diǎn)燃大鼠海馬組織中存在 ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞。在海馬 CA3 區(qū)，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物 MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。(C) PTZ 點(diǎn)燃大鼠顳皮質(zhì)中存在 ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞。在大鼠顳皮質(zhì)中，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。比例尺=

圖 1.3 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定 ZAG 的表達(dá)。(A) ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在 TLE 患者和對(duì)照組患者的的顳葉皮質(zhì)中。(B)條形圖顯示，TLE 患者的 ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞的 IOD 值與對(duì)照組相比明顯減低。(C, E) ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在癲癇大鼠和對(duì)照組大鼠的海馬 CA3 區(qū)與相鄰皮質(zhì)。(D,F)條形圖顯示，癲癇大鼠的海馬 CA3 區(qū)與相鄰皮質(zhì)的 ZAG 陽(yáng)性細(xì)胞的 IOD 值明顯低于對(duì)照組。IOD: 積分光密度。*P<0.05，與對(duì)照組相比。比例尺= 50μm。Fig 1.3 ZAG expression was measured by immunohistochemistry. (A) ZAG-positive cells in the temporalneocortices of the control and intractable TLE patients. (B) The bar graph shows that the IOD ofZAG-positive cells from the TLE patients was decreased compared with that of the controls . (C, E)ZAG-positive cells in the temporal neocortices and hippocampal CA3 regions of the control and TLE rats.(D,F) The respective bar graph shows that the IOD of ZAG-positive cells was decreased in the temporalneocortices and hippocampal CA3 region of the epileptic rats compared with that of the controls. IOD:Integrated optic density. *P<0.05 versus control. Scale bar = 50 μm.2.5 蛋白印跡檢測(cè) ZAG 蛋白在難治性癲癇患者和 PTZ 點(diǎn)燃大鼠腦組織中的表達(dá)RT-qPCR 結(jié)果顯示 AZGP1 mRNA 在 TLE 患者以及癲癇大鼠的腦組織中表達(dá)

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1 張景梅;梁洪s

本文編號(hào)：2764115