【摘要】：第一部分ZAG在癲癇患者及癲癇動物模型腦組織中的表達(dá)目的:探究ZAG在難治性TLE患者皮質(zhì)及PTZ點(diǎn)燃癲癇大鼠模型海馬、皮質(zhì)組織中的表達(dá)及其表達(dá)變化。方法:1.收集腦外傷患者手術(shù)切除的皮質(zhì)為對照組(n=20),TLE患者行癲癇灶切除的皮質(zhì)為癲癇組(n=14)。同時,建立PTZ大鼠癲癇模型(n=20),對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(n=20);2.運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)研究顳葉癲癇患者和癲癇大鼠腦組織中ZAG的細(xì)胞定位。運(yùn)用RT-q PCR、免疫組織化學(xué)及Western blot方法測定癲癇患者和癲癇大鼠腦組織中AZGP1 m RNA和ZAG蛋白表達(dá)量的差異;3.運(yùn)用蛋白免疫印跡方法檢測PTZ腹腔注射1天、1周、2周、3周和4周的大鼠腦組織中ZAG的蛋白表達(dá)量的變化情況。結(jié)果:1.免疫熒光染色結(jié)果顯示,ZAG主要表達(dá)于人腦組織以及大鼠腦組織中的神經(jīng)元胞質(zhì);2.RT-q PCR結(jié)果顯示癲癇患者及癲癇大鼠腦組織中AZGP1的m RNA水平較對照組明顯降低(P0.05);3.免疫組織化學(xué)染色和Western blot結(jié)果顯示ZAG在癲癇患者以及癲癇大鼠模型中水平下降(P0.05);4.在癲癇模型大鼠腦組織中的ZAG表達(dá)水平隨PTZ注射時間的延長呈進(jìn)行性加重。結(jié)論:ZAG存在于腦組織中,且其可能是由神經(jīng)元合成,而不是星形膠質(zhì)細(xì)胞。AZGP1 m RNA及ZAG蛋白表達(dá)水平在TLE患者與癲癇大鼠模型腦組織中均下降。癲癇大鼠模型腦組織中ZAG蛋白水平與PTZ注射時間呈負(fù)相關(guān)。ZAG的下降可能在癲癇的發(fā)病機(jī)制及病理生理中具有重要作用。第二部分ZAG在癲癇發(fā)作中的作用機(jī)制目的:探索ZAG在癲癇中的可能作用機(jī)制。方法:1.驗(yàn)證AAV的轉(zhuǎn)染效果:將成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四個組(n=20):對照組(Control)、空病毒組(GFP)、AAV注射后3周組(AZGP1-3W)及、AAV注射后9周組(AZGP1-9W)。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡觀察、RT-q PCR及Western Blot分別檢測AAV注射后3周及9周的轉(zhuǎn)染效果;2.探索過表達(dá)AZGP1在PTZ大鼠模型中可能的作用機(jī)制:另取45只SD大鼠隨機(jī)分為三個組:對照組(Control)、癲癇組(GFP+PTZ)及過表達(dá)病毒組(AZGP1+PTZ)。AZGP1+PTZ與GFP+PTZ組大鼠在AAV注射后3周起,每日接受PTZ腹腔注射共28天,Control組大鼠接受同等劑量的生理鹽水腹腔注射。觀察各組大鼠的行為學(xué)及腦電圖(EEG)差異。運(yùn)用Co-IP檢測癲癇組大鼠腦組織中ZAG與p-ERK及ZAG與TGFβ之間是否存在相互結(jié)合。運(yùn)用Western Blot檢測各組之間大鼠腦組織中炎癥因子TNFα,IL-6,TGFβ,ERK及p-ERK的表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.AAV-AZGP1和AAV-GFP海馬立體定位注射后,綠色熒光結(jié)果顯示海馬CA3區(qū)有GFP陽性表達(dá)。RT-qPCR及免疫印跡及結(jié)果顯示,與相應(yīng)時間點(diǎn)對照組相比,AZGP1過表達(dá)組AZGP1 m RNA及ZAG蛋白在病毒注射后第3周和第9周顯著增加(P0.05);2.Co-IP結(jié)果顯示ZAG可以與p-ERK及TGFβ結(jié)合;3.過表達(dá)AZGP1可以降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇大鼠模型的癲癇發(fā)作評分,延長PTZ點(diǎn)燃的潛伏期,并緩解癲癇樣放電的程度;4.過表達(dá)AZGP1可以減輕PTZ癲癇模型大鼠的腦組織中TNFα,IL-6,TGFβ水平的升高,并降低ERK的磷酸化水平。結(jié)論:ZAG可能通過與TGFβ及p ERK之間的相互作用參與癲癇發(fā)生。ZAG可能通過抑制TGFβ介導(dǎo)的ERK磷酸化以及TNFα和IL-6介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥從而抑制癲癇發(fā)作。ZAG可能是治療癲癇的潛在新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1
【圖文】：

差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1.1)。圖 1.1 通過 RT-qPCR 檢測 AZGP1 的 mRNA 在 TLE 患者和 PTZ 點(diǎn)燃大鼠的腦組織中的表達(dá)水平，GAPDH 作為內(nèi)參基因。(A）RT-qPCR 結(jié)果顯示 TLE 患者顳皮質(zhì)中 AZGP1 mRNA 水平較對照組明顯減低

28圖 1.2 免疫熒光雙標(biāo)檢測 ZAG 的細(xì)胞表達(dá)定位。(A) TLE 患者的顳葉皮質(zhì)中存在 ZAG 陽性細(xì)胞。在顳葉皮質(zhì)中，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物 MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。(B) PTZ 點(diǎn)燃大鼠海馬組織中存在 ZAG 陽性細(xì)胞。在海馬 CA3 區(qū)，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物 MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。(C) PTZ 點(diǎn)燃大鼠顳皮質(zhì)中存在 ZAG 陽性細(xì)胞。在大鼠顳皮質(zhì)中，ZAG(綠色)與神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2(紅色）共表達(dá)，但未與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 GFAP（紅色）及 DAPI 標(biāo)記的細(xì)胞核（藍(lán)色）。比例尺=

圖 1.3 免疫組織化學(xué)染色測定 ZAG 的表達(dá)。(A) ZAG 陽性細(xì)胞表達(dá)在 TLE 患者和對照組患者的的顳葉皮質(zhì)中。(B)條形圖顯示，TLE 患者的 ZAG 陽性細(xì)胞的 IOD 值與對照組相比明顯減低。(C, E) ZAG 陽性細(xì)胞表達(dá)在癲癇大鼠和對照組大鼠的海馬 CA3 區(qū)與相鄰皮質(zhì)。(D,F)條形圖顯示，癲癇大鼠的海馬 CA3 區(qū)與相鄰皮質(zhì)的 ZAG 陽性細(xì)胞的 IOD 值明顯低于對照組。IOD: 積分光密度。*P<0.05，與對照組相比。比例尺= 50μm。Fig 1.3 ZAG expression was measured by immunohistochemistry. (A) ZAG-positive cells in the temporalneocortices of the control and intractable TLE patients. (B) The bar graph shows that the IOD ofZAG-positive cells from the TLE patients was decreased compared with that of the controls . (C, E)ZAG-positive cells in the temporal neocortices and hippocampal CA3 regions of the control and TLE rats.(D,F) The respective bar graph shows that the IOD of ZAG-positive cells was decreased in the temporalneocortices and hippocampal CA3 region of the epileptic rats compared with that of the controls. IOD:Integrated optic density. *P<0.05 versus control. Scale bar = 50 μm.2.5 蛋白印跡檢測 ZAG 蛋白在難治性癲癇患者和 PTZ 點(diǎn)燃大鼠腦組織中的表達(dá)RT-qPCR 結(jié)果顯示 AZGP1 mRNA 在 TLE 患者以及癲癇大鼠的腦組織中表達(dá)

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1 張景梅;梁洪s

本文編號：2764115