【摘要】：研究背景紫杉醇是臨床上最常用的化療藥物之一,通常用于胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等癌癥的治療。然而,紫杉醇治療通常誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛(paclitaxel-induced neuropathic pain,PINP),且在停藥后仍可能持續(xù)很長時間。常用的鎮(zhèn)痛藥物如非甾體類抗炎藥、阿片類藥物、抗驚厥藥及抗抑郁藥等對PINP的治療效果極差。PINP嚴(yán)重影響腫瘤患者的預(yù)后和生存質(zhì)量,且目前缺乏有效的防治措施。因此,深入探討PINP的治療靶點是我們亟需解決的關(guān)鍵問題。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),如G蛋白偶聯(lián)受體、生長因子及抗氧化酶等。PPARγ不僅在代謝調(diào)控方面發(fā)揮不可或缺的作用,大量的研究還表明PPARγ激活在缺血再灌注損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)退行性疾病中均起到保護(hù)作用。近年來,越來越多的證據(jù)表明PPARγ可能是治療慢性疼痛的潛在藥物靶點。Park等首次證實PPARγ激動劑吡格列酮可以有效預(yù)防脊髓損傷大鼠模型產(chǎn)生熱痛覺過敏。此外,PPARγ激動劑還可以顯著緩解炎性痛及神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛。然而,PPARγ激活能否有效防治PINP及其機制目前尚不明確。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子。生理情況下,Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中與Keap1結(jié)合,然后發(fā)生泛素化和快速降解。然而,Nrf2在氧化應(yīng)激情況下與Keap1分開,在細(xì)胞質(zhì)中聚集并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),從而結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件,然后激活抗氧化基因的表達(dá),如血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等。研究表明活性氧清除劑可以有效防治PINP,這說明氧化應(yīng)激參與PINP的發(fā)生及發(fā)展。大量研究證實Nrf2是抵抗氧化應(yīng)激損傷的重要治療靶點。然而,Nrf2/HO-1信號通路激活能否有效防治PINP目前尚不明確。鑒于PPARγ激活所產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)大多是由其抗氧化功能所介導(dǎo)的,我們推測PPARγ可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路來緩解PINP。因此,本研究擬采用腹腔注射紫杉醇建立大鼠PINP模型,采用不同給藥方案檢測PPARγ激動劑及Nrf2激動劑對PINP發(fā)生及發(fā)展的影響,采用免疫熒光及western blot檢測PPARγ、Nrf2及HO-1在脊髓的表達(dá)及分布情況,從而驗證科學(xué)假說。研究方法與結(jié)果第一部分PPARγ激活緩解紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作為研究對象,于第0天(0 d)、2 d、4 d及6 d腹腔注射紫杉醇建立PINP模型,于0 d給藥前、3 d、7 d、14 d及21 d采用Von Frey絲評估雙側(cè)足底機械性縮爪閾值(mechanical paw withdrawal threshold,MPWT)。于14 d腹腔注射羅格列酮,檢測單次腹腔注射PPARγ激動劑對PINP大鼠MPWT的影響;于14-18 d連續(xù)5天腹腔注射羅格列酮,檢測多次腹腔注射PPARγ激動劑對PINP大鼠MPWT的影響;于14 d腹腔注射羅格列酮前30 min先腹腔注射PPARγ拮抗劑,檢測PPARγ拮抗劑對羅格列酮緩解PINP的影響;于0-6 d連續(xù)7天腹腔注射羅格列酮,檢測預(yù)防性腹腔注射PPARγ激動劑對PINP大鼠MPWT的影響。采用免疫熒光及western blot檢測PPARγ的表達(dá)、分布及細(xì)胞定位情況。結(jié)果:PINP組大鼠MPWT于7 d開始顯著下降,一直持續(xù)至21 d,而Vehicle組大鼠MPWT在整個觀察期間沒有顯著改變。14 d單次腹腔注射羅格列酮5 mg/kg對PINP大鼠MPWT沒有顯著影響,而腹腔注射羅格列酮25 mg/kg及50 mg/kg可以顯著升高PINP大鼠MPWT,于給藥后1 h開始起效,2 h藥效達(dá)峰,4 h藥效消失。此外,14-18 d多次腹腔注射羅格列酮顯著升高PINP大鼠MPWT,且不出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。事先腹腔注射PPARγ拮抗劑顯著逆轉(zhuǎn)了羅格列酮對PINP的緩解作用。預(yù)防性腹腔注射羅格列酮顯著提高PINP大鼠在7 d及14 d的MPWT,而對21 d的MPWT無顯著影響。PINP大鼠脊髓PPARγ表達(dá)水平顯著降低,而多次腹腔注射羅格列酮顯著上調(diào)PINP大鼠脊髓PPARγ的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予PPARγ拮抗劑所阻斷。PPARγ主要與神經(jīng)元共表達(dá),極少數(shù)與小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)。第二部分Nrf2/HO-1信號通路激活緩解紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作為研究對象,PINP模型建立方法同第一部分。于14 d腹腔注射奧替普拉,檢測單次腹腔注射Nrf2激動劑對PINP大鼠MPWT的影響;于14-18 d連續(xù)5天腹腔注射奧替普拉,檢測多次腹腔注射Nrf2激動劑對PINP大鼠MPWT的影響;于14 d腹腔注射奧替普拉前30 min先腹腔注射葫蘆巴堿,檢測Nrf2抑制劑對奧替普拉緩解PINP的影響;于0-6 d連續(xù)7天腹腔注射奧替普拉,檢測預(yù)防性腹腔注射Nrf2激動劑對PINP大鼠MPWT的影響。采用免疫熒光和western blot檢測Nrf2及HO-1的表達(dá)、分布及細(xì)胞定位情況。結(jié)果:14 d單次腹腔注射奧替普拉10 mg/kg對PINP大鼠MPWT沒有顯著影響,而腹腔注射奧替普拉50 mg/kg及100 mg/kg可以顯著升高PINP大鼠MPWT,于給藥后0.5 h開始起效,1 h藥效達(dá)峰,2 h藥效消失。此外,14-18 d多次腹腔注射奧替普拉顯著升高PINP大鼠MPWT,且不出現(xiàn)耐受現(xiàn)象。事先腹腔注射Nrf2抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了奧替普拉對PINP的緩解作用。預(yù)防性腹腔注射奧替普拉顯著提高PINP大鼠在7 d的MPWT,而對14 d及21 d的MPWT無顯著影響。PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1表達(dá)水平顯著升高,而多次腹腔注射奧替普拉進(jìn)一步上調(diào)PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予Nrf2抑制劑所阻斷。Nrf2及HO-1主要與神經(jīng)元共表達(dá),極少數(shù)與星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)。第三部分PPARγ通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解紫杉醇誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛方法:采用雄性SD大鼠作為研究對象,PINP建模方法同第一部分。于14 d腹腔注射羅格列酮前30 min先腹腔注射葫蘆巴堿,檢測Nrf2抑制劑對羅格列酮緩解PINP的影響;采用免疫熒光和western blot檢測Nrf2及HO-1的表達(dá)及分布情況。結(jié)果:14 d單次腹腔注射羅格列酮50 mg/kg可以顯著升高PINP大鼠MPWT。然而,事先腹腔注射Nrf2抑制劑葫蘆巴堿20 mg/kg顯著逆轉(zhuǎn)了羅格列酮對PINP的緩解作用。此外,Nrf2和HO-1的表達(dá)在PINP大鼠脊髓中顯著升高,而多次腹腔注射羅格列酮進(jìn)一步上調(diào)PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予Nrf2抑制劑所阻斷。免疫熒光結(jié)果與western blot結(jié)果一致。統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá),并用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。Western blot結(jié)果采用單因素方差分析,行為學(xué)結(jié)果采用雙因素方差分析。p0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。研究總結(jié)1.主要研究結(jié)果1.1單次及多次腹腔注射PPARγ激動劑均顯著升高PINP大鼠MPWT,且能被PPARγ拮抗劑所阻斷;預(yù)防性腹腔注射PPARγ激動劑顯著提高PINP大鼠在7 d及14d的MPWT,而對21 d的MPWT無顯著影響;PINP大鼠脊髓PPARγ表達(dá)水平顯著降低,而多次腹腔注射PPARγ激動劑顯著上調(diào)PINP大鼠脊髓PPARγ的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予PPARγ拮抗劑所阻斷;PPARγ主要與神經(jīng)元共表達(dá),極少數(shù)與小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)。1.2單次及多次腹腔注射Nrf2激動劑均顯著升高PINP大鼠MPWT,且能被Nrf2抑制劑所阻斷;預(yù)防性腹腔注射Nrf2激動劑顯著提高PINP大鼠在7 d的MPWT,而對14 d及21 d的MPWT無顯著影響;PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1表達(dá)水平顯著升高,而多次腹腔注射Nrf2激動劑進(jìn)一步上調(diào)PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予Nrf2抑制劑所阻斷;Nrf2及HO-1主要與神經(jīng)元共表達(dá),極少數(shù)與星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)。1.3單次腹腔注射PPARγ激動劑顯著升高PINP大鼠MPWT,且能被Nrf2抑制劑所阻斷;多次腹腔注射PPARγ激動劑進(jìn)一步上調(diào)PINP大鼠脊髓Nrf2及HO-1的表達(dá)水平,但這一效果被事先給予Nrf2抑制劑所阻斷。2.研究結(jié)論2.1 PPARγ激活可顯著緩解已經(jīng)存在的PINP,且可以延緩PINP的發(fā)生。2.2 Nrf2激活可顯著緩解已經(jīng)存在的PINP,且可以延緩PINP的發(fā)生。2.3 PPARγ通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解PINP。3.創(chuàng)新之處3.1首次證實PPARγ激動劑羅格列酮可以顯著緩解PINP,并揭示PPARγ主要表達(dá)在脊髓神經(jīng)元。3.2首次證實Nrf2激動劑奧替普拉可以有效緩解PINP,并揭示Nrf2及HO-1主要表達(dá)在脊髓神經(jīng)元。3.3揭示了PPARγ激活緩解PINP的機制是激活脊髓神經(jīng)元Nrf2/HO-1信號通路。4.展望4.1羅格列酮是臨床上治療II型糖尿病的常用藥物。本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可顯著緩解大鼠PINP,然而羅格列酮能否改善患者的PINP仍需進(jìn)一步的臨床試驗來證實。4.2奧替普拉曾被用于治療血吸蟲,現(xiàn)已被批準(zhǔn)用于治療肝纖維化和脂肪肝的III期臨床試驗。本研究發(fā)現(xiàn)奧替普拉可顯著緩解大鼠PINP,然而奧替普拉能否改善患者的PINP仍需進(jìn)一步的臨床試驗來證實。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R741
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本文編號：
2762528
