【摘要】：研究背景近年來(lái)相關(guān)研究報(bào)道顯示,腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和多發(fā)性硬化的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。神經(jīng)炎癥是由于感染和損傷所引發(fā)的機(jī)體抵御機(jī)制,主要是由膠質(zhì)細(xì)胞與淋巴細(xì)胞釋放的毒性因子介導(dǎo)所引起的。在先前動(dòng)物模型使用的研究中,發(fā)現(xiàn)在大腦發(fā)生炎癥時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活,釋放促炎癥因子和抗炎因子以介導(dǎo)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。本次研究主要針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行研究,探討研究小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要作用,為干預(yù)炎癥反應(yīng)進(jìn)展提供新的研究方向。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中最小的膠質(zhì)細(xì)胞,數(shù)量少,大概為CNS神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的10%~20%。小膠質(zhì)細(xì)胞在大腦神經(jīng)組織中扮演著主要免疫細(xì)胞的角色,同時(shí)也是神經(jīng)相關(guān)炎癥反應(yīng)的最重要的免疫細(xì)胞。同時(shí),無(wú)論在神經(jīng)元的生存還是生命活動(dòng)中都發(fā)揮著重要的支持、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)等作用,并且其外形與免疫系統(tǒng)樹(shù)突狀抗原呈遞細(xì)胞相似,有效保護(hù)CNS免于病原體侵蝕。小膠質(zhì)細(xì)胞在激活的時(shí)候會(huì)釋放炎癥前細(xì)胞因子,如IL-1、TNF-α以及氮氧化物在內(nèi)的一系列的炎性因子。在CNS的炎癥過(guò)程中小膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)也表達(dá)許多細(xì)胞因子的受體,包括炎癥前細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子受體,在調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫功能上起關(guān)鍵的作用。最近,也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道小膠質(zhì)細(xì)胞與一些神經(jīng)退行性病變的疾病進(jìn)程有一定的關(guān)聯(lián)。所以,對(duì)于神經(jīng)炎癥的研究中,針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥表達(dá)的治療是對(duì)神經(jīng)炎癥治療過(guò)程中一個(gè)重要的策略。核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcriptrion factorκB,NF-κB)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞里具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì),一般該蛋白以非激活的形式存在在幾乎所有類型細(xì)胞的胞質(zhì)。NF-κB的激活可以通過(guò)多種細(xì)胞外信號(hào)進(jìn)行調(diào)控NF-κB的靶基因。NF-κB在免疫應(yīng)答、細(xì)胞增生及凋亡等重要功能發(fā)揮至關(guān)重要的作用,同時(shí)也與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)變性及可塑性變化等有關(guān)。吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)是目前NF-κB的活性抑制劑。PDTC能夠改變氧化還原狀態(tài),金屬螫合作用,降低或抑制酶活性,能夠抑制通過(guò)激活NF-κB途徑在小膠質(zhì)等多種細(xì)胞的反應(yīng)。PDTC由二硫代氨基甲酸酯組成,能分解成異硫氰酸鹽和二硫化碳這兩種低分子硫醇抗氧化劑,影響NF-κB的DNA結(jié)合活性,從而減少NF-κB的活化;另外PDTC還可以直接抑制NF-κB,在LPS誘導(dǎo)的小鼠膿毒性休克模型的研究發(fā)現(xiàn),PDTC是通過(guò)減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位,抑制NF-κB的活化,使致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-6基因的表達(dá)減少,炎性反應(yīng)減輕,降低了小鼠的死亡率。PDTC作為一種抗氧化劑,還可以清除自由基的毒性作用,可以通過(guò)減少丙二醛等來(lái)降低氧化物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷,能夠用于重金屬中毒和酒精中毒的解毒、癌癥和獲得性免疫抑郁綜合征等疾病的輔助治療。因此,本研究旨在探討脂多糖對(duì)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響并觀察PDTC對(duì)其的干預(yù)效應(yīng)。研究目的1、觀測(cè)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)對(duì)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。2、探討吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)效應(yīng)研究方法1、細(xì)胞培養(yǎng)BV-2神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g/L青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃、95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。每48h換液、傳代2次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2、對(duì)BV-2細(xì)胞進(jìn)行傳代并隨機(jī)分為空白照組、L組和L+P組。3、其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS;L組加入LPS(1μg/ml);L+P組在加入LPS前30分鐘加入50μmol/L的PDTC溶液進(jìn)行干預(yù)并置于培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。4、經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后,用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變,采用ELISA法測(cè)定BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6含量,同時(shí)對(duì)細(xì)胞行免疫組化和Western blot觀察蛋白表達(dá)量的改變。結(jié)果1.光鏡下,O組、L組和L+P組BV-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變。靜止?fàn)顟B(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)為分支狀胞體呈圓形或者橢圓形。L組的BV-2細(xì)胞經(jīng)LPS(1ug/ml)24小時(shí)因刺激后活化的細(xì)胞數(shù)量明顯增加,細(xì)胞核體積明顯變大,并且細(xì)胞形態(tài)成“阿米巴樣”改變。然而,經(jīng)PDTC預(yù)先處理的L+P組中,在加入LPS 30分鐘前給予PDTC(50ug/L)進(jìn)行預(yù)處理,活化形態(tài)發(fā)生變化的BV-2細(xì)胞相對(duì)于LPS組明顯減少。通過(guò)統(tǒng)計(jì)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)量的比值我們可以得到相同的結(jié)果。L組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的比值明顯高于對(duì)照組(P0.05),而預(yù)先給予PDTC進(jìn)行處理的L+P組明顯降低活化細(xì)胞比值(P0.05)。2.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的結(jié)果中與O組比較,L組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度增高(P0.05);與L組比較,L+P組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度降低(P0.05)。3.通過(guò)Western blot結(jié)果顯示與O組比較,L組中NF-κB p65與TLR4在BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增加(P0.05);與L組比較,L+P組中NF-κB p65與TLR4在BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量明顯減少(P0.05)。結(jié)論1、LPS可誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞激活發(fā)生形態(tài)變化,并且促使BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎癥因子。2、應(yīng)用PDTC可干預(yù)LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,減少其炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產(chǎn)生。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741
【圖文】：

L+P 組圖 1 O 組、L 組與 L+P 組細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)比測(cè)細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度的結(jié)果培養(yǎng)后，取細(xì)胞上清液離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物分裝清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度。 檢測(cè)結(jié)果顯示 L 組與空白對(duì)照組比較，L 組細(xì)胞上清液中 T（P < 0.05）；與 LPS 組比較，L+P 組細(xì)胞上清液 TNF-α、 < 0.05），見(jiàn)表 2 和圖 2。表 2 細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度的比較（pg/ml，n=3，O 組 L 組 L+P 組104.1±10.6 141.2±10.2*114.7±5.1&220.9±46.3 350.1±9.5*256.1±51.837.9±6.9 59.9±3.9*43.8±6.8&注：與 O 組比較，*P < 0.05；與 L 組比較，&P < 0.05

GroupOGroupLGroupL+P0204060IL-6(pg/ml)圖 2 血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 濃t 結(jié)果時(shí)后取出細(xì)胞用細(xì)胞刮提取細(xì)胞，并用65、TLR4 不同組之間的表達(dá)情況。：與 O 組比較，L 組中 NF-κB p65 在 ）；與 L 組比較，L+P 組中 NF-κB p60.05）。O組 L組 L+P組

κB p65、TLR4 不同組之間的表達(dá)情況。p65：與 O 組比較，L 組中 NF-κB p65 在.05）；與 L 組比較，L+P 組中 NF-κB P < 0.05）。B P65ctinO組 L組 L+P組組 NF-κB p65 蛋白表達(dá)結(jié)果，與 O 組比較，與 O 組比較，L 組中 TLR4 在 BV-2 小比較，L+P 組中 TLR4 在 BV-2 小膠質(zhì)細(xì)O組 L組 L+P組

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