【摘要】：膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤之一。目前的治療標(biāo)準(zhǔn)是在可行的范圍內(nèi)手術(shù)切除,輔助放療、化療等。伊維菌素(Ivermectin,IVM)、莫西克汀(Moxidectin,MOX)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,在體外和體內(nèi)均有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用,因此被認(rèn)為是潛在的抗癌藥物。細(xì)胞自噬與凋亡是引起腫瘤細(xì)胞死亡的主要途徑,自噬在腫瘤治療中的作用成為研究熱點(diǎn)。目前關(guān)于伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬作用及機(jī)制尚不明確。因此,本研究選用伊維菌素、莫西克汀兩種藥物,以人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6為研究對(duì)象。用透射電子顯微鏡、GFP-LC3轉(zhuǎn)染、Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)自噬發(fā)生;MTT法和平板克隆法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力;流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞荷瘤模型,證明兩種藥物在體內(nèi)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤自噬發(fā)生及作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬作用及機(jī)制,明確自噬在藥物治療過程中的作用,為干預(yù)自噬并聯(lián)合伊維菌素、莫西克汀治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。研究結(jié)果如下:(1)伊維菌素、莫西克汀在體外誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬發(fā)生用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果顯示:藥物處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有明顯的自噬小體;GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可定位蛋白,追蹤自噬形成,結(jié)果顯示:藥物處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中彌散的綠色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)槊髁涟唿c(diǎn);用Western blot檢測(cè)標(biāo)志性自噬蛋白表達(dá)水平變化,結(jié)果顯示:藥物處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平顯著升高(P0.001),而P62表達(dá)水平顯著降低(P0.01)。(2)伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬發(fā)生的機(jī)制用Western blot檢測(cè)自噬信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:隨著伊維菌素、莫西克汀藥物濃度升高,AKT/mTOR信號(hào)通路上自噬蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.001)。其次,檢測(cè)ATP水平,經(jīng)藥物處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ATP水平顯著降低(P0.01)。(3)伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系用CQ抑制自噬,MTT法和平板克隆法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示:抑制伊維菌素誘導(dǎo)的自噬后細(xì)胞增殖活力降低(P0.01),細(xì)胞集落形成率也降低(P0.01),細(xì)胞凋亡率升高(P0.05);而抑制莫西克汀誘導(dǎo)的自噬后細(xì)胞增殖活力升高(P0.05),細(xì)胞集落形成率升高(P0.01),細(xì)胞凋亡率降低(P0.01)。(4)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞荷瘤模型中,伊維菌素、莫西克汀誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤自噬發(fā)生用U251細(xì)胞建立膠質(zhì)瘤細(xì)胞荷瘤模型。Western blot和免疫組織化學(xué)法(LC3)檢測(cè)藥物處理后膠質(zhì)瘤組織中蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示:藥物處理過的膠質(zhì)瘤組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高,LC3陽性表達(dá)升高,證明藥物在體內(nèi)也可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤自噬發(fā)生。(5)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞荷瘤模型中,自噬與凋亡的關(guān)系實(shí)驗(yàn)過程中記錄裸鼠皮下腫瘤體積,根據(jù)腫瘤體積趨勢(shì)和最終體積可以看出:抑制伊維菌素誘導(dǎo)的自噬可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤死亡,膠質(zhì)瘤體積顯著變小(P0.05);而抑制莫西克汀誘導(dǎo)的自噬降低細(xì)胞死亡,腫瘤體積增大(P0.01)。免疫組織化學(xué)法(Ki67)和TUNEL法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:抑制伊維菌素誘導(dǎo)的自噬Ki67陽性表達(dá)降低,熒光表達(dá)增多,證明在體內(nèi)自噬抑制凋亡,降低伊維菌素的治療效果;而抑制莫西克汀誘導(dǎo)的自噬Ki67陽性表達(dá)升高,熒光表達(dá)減少。證明莫西克汀誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)凋亡,自噬與凋亡共同促進(jìn)膠質(zhì)瘤死亡。綜上所述,伊維菌素和莫西克汀在體外、體內(nèi)均能顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬發(fā)生,通過抑制AKT/mTOR信號(hào)通路,并引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞能量降低。在探究自噬與凋亡的關(guān)系中,伊維菌素誘導(dǎo)的自噬抑制凋亡,而莫西克汀誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)凋亡。由此可以看出自噬在腫瘤治療過程中扮演雙重角色。因此,干預(yù)自噬并聯(lián)合伊維菌素,莫西克汀將可能成為治療膠質(zhì)瘤的有效途徑。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.4
【圖文】：

圖 1-1 伊維菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-1 Chemical structure of ivermectin菌素應(yīng)用現(xiàn)狀是一種廣譜的抗寄生蟲劑，它具有獨(dú)特的藥理特性�？梢砸种萍模瑢�(dǎo)致咽壁肌肉癱瘓，從而導(dǎo)致寄生蟲餓死，有效的用于對(duì)寄生不僅用于人類口服治療絲蟲病的藥物，對(duì)其他與蠕蟲有關(guān)的感染多國(guó)家被批準(zhǔn)用于治療盤尾絲蟲病、淋巴絲蟲病、強(qiáng)線蟲病，最，越來越多的科研工作者和衛(wèi)生工作者應(yīng)用伊維菌素來治療其他的藥物動(dòng)力及生物化學(xué)作用方式，更好的將伊維菌素應(yīng)用于人類，阿維菌素的發(fā)現(xiàn)榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[18-19]�，F(xiàn)有文獻(xiàn)描述疾病方面的報(bào)道。阿維菌素可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的電離受體有乙醇影響的細(xì)胞和行為效應(yīng)，并可能代表一種新型的抗酒精藥究證明，阿維菌素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖，促進(jìn)凋亡的作菌素同屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，隨后將目光轉(zhuǎn)向伊維菌素。伊維菌

臨床治療中找到了一席之地，是治療絲蟲病最成功的藥物之一[17為是一種很有前途的抗癌藥物[24]。Dou QH 等表明伊維菌素通過阻細(xì)胞自噬[25]。Liu Y 等報(bào)道伊維菌素抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血管生成、imoto 等研究表明伊維菌素能抑制人卵巢癌的 PAK 1 激酶，并阻斷研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以作為有效的 MDR 逆轉(zhuǎn)劑[27]。同可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡。因此，伊維菌素有望成為克汀克汀簡(jiǎn)介大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中，莫西克�。∕oxidectin, MOX）屬于米爾貝酯類藥物。由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，是奈馬克丁的衍生物，成分單一相似，有很高的親脂性，同時(shí)具備較強(qiáng)的殺蟲活性[29-30]。在獸醫(yī)生蟲，具有長(zhǎng)效、安全的優(yōu)點(diǎn)[31-32]。其結(jié)構(gòu)分子式見圖 1-2。

前 言blot 法檢測(cè)腫瘤組織蛋白中自噬蛋白的變化；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織切片中自噬蛋白的表達(dá)。其次，證明體內(nèi)自噬與凋亡的關(guān)系，探究自噬與凋亡對(duì)藥物抗腫瘤的作用。通過記錄腫瘤體積和裸鼠體重；免疫組織化學(xué)（Ki67）檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)；TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。1.6 本課題的研究技術(shù)路線

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本文編號(hào)：2761847