【摘要】：神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是小兒最常見的顱外腫瘤,起源于腎上腺的腎上嵴,約占小兒所有惡性腫瘤的10%,其惡性程度高,病程進展快,多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時已為Ⅲ、Ⅳ期。目前,雖然隨著綜合治療措施(如手術(shù)前的放化療、化療加用造血干細胞移植等)的實行,但神經(jīng)母細胞瘤的治愈率并沒有明顯提高,Ⅳ期患兒的2年生存率僅為19%,而對于復發(fā)、轉(zhuǎn)移的晚期患兒多在短短數(shù)月內(nèi)死亡。尋找更有效的神經(jīng)母細胞瘤的治療手段是提高其治愈率所急需的。2010年開始,我們利用溶瘤病毒攜帶小干擾RNA或抑癌基因IL-24及IL-24重組蛋白等,研究其對神經(jīng)母細胞瘤的治療作用。結(jié)果顯示IL-24能夠有效抑制神經(jīng)母細胞瘤的生長、誘導凋亡,同時能夠抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移,更感興趣的是我們發(fā)現(xiàn)IL-24重組蛋白能夠誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化。研究結(jié)果發(fā)表在Journal of InterferonCytokine Research、tumor Biology、oncology report。本課題擬研究在前期研究溶瘤病毒ZD55-sh MYCN及IL-24治療神經(jīng)母細胞瘤的基礎(chǔ)上,為增強溶瘤病毒靶向感染腫瘤干細胞能力,用35型腺病毒Fiber的knob結(jié)構(gòu)替換5型腺病毒的knob結(jié)構(gòu),為進一步提高病毒的治療效果,攜帶IL-24基因作為治療基因,構(gòu)建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24。在細胞和動物水平檢測ZD55.F35-IL.24對神經(jīng)母細胞瘤-腫瘤干細胞的治療效果,為進一步臨床應用研究奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三部分闡述:第一部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24的構(gòu)建及擴增純化目的:利用攜帶IL-24基因的溶瘤病毒穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24和Ad5/35嵌合型纖毛的溶瘤病毒骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35共轉(zhuǎn)染293細胞包裝成完整的新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并鑒定和擴增。方法:將293細胞鋪于10cm平皿,按細胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行操作。將穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24等分別與骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35通過Effectene共轉(zhuǎn)染至293細胞,9-14天出現(xiàn)病毒空斑,經(jīng)過病毒空斑純化,進行擴增,提取重組腺病毒的DNA。病毒DNA的抽提按照試劑盒說明書進行操作,獲得重組病毒ZD55.F35-IL.24。通過PCR分別鑒定病毒中是否插入IL-24、及35型Fiber。鑒定正確的病毒分別感染293細胞,擴增病毒,Cs Cl梯度離心法純化病毒,50%組織培養(yǎng)感染量(TCID50)法測病毒滴度。結(jié)果:穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24等分別與骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35通過Effectene共轉(zhuǎn)染293細胞,病毒空斑純化并擴增,獲得重組腺病毒的DNA。以重組病毒基因組為模板PCR擴增獲得IL-24基因和Fiber基因,說明溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24重組成功。將ZD55.F35-IL.24感染293細胞擴增病毒,Cs Cl梯度離心純化病毒,-80℃保存?zhèn)溆谩＝Y(jié)論:成功構(gòu)建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并進一步擴增、純化病毒,為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。第二部分神經(jīng)母細胞瘤細胞BE(2)-C中干細胞分選、鑒定目的:無血清懸浮培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法相結(jié)合從人神經(jīng)母細胞瘤BE(2)-C細胞系中誘導培養(yǎng)腫瘤干細胞并分選鑒定。方法:神經(jīng)母細胞瘤BE(2)-C細胞接種于含多種生長因子的無血清細胞培養(yǎng)液中,通過誘導培養(yǎng)獲得含有大量神經(jīng)母細胞瘤干細胞的干細胞球。細胞免疫熒光檢測神經(jīng)母細胞瘤干細胞標志蛋白CD133和Nestin的表達。進一步將干細胞球制成單細胞懸液,用CD133標記的免疫磁珠對細胞懸液中的神經(jīng)母細胞瘤干細胞進行分選。MTT法和細胞單克隆形成率實驗檢測分選的CD133+和CD133-的細胞的增殖活性。結(jié)果:在含血清的完全細胞培養(yǎng)液中,BE(2)-C細胞貼壁生長,增殖快。在含多種細胞因子的無血清細胞培養(yǎng)液中,48小時內(nèi),BE(2)-C細胞大部分貼壁生長,少部分細胞呈單細胞懸浮狀態(tài)。48小時后,開始形成小細胞團懸浮于培養(yǎng)基中,隨著培養(yǎng)時間延長,細胞團逐漸增大,形成典型的神經(jīng)母細胞瘤干細胞球。細胞免疫熒光檢測證明干細胞球上高表達CD133和Nestin蛋白。流式細胞儀檢測結(jié)果示免疫磁珠分選獲得的CD133+細胞比例達到93.8%。MTT檢測結(jié)果示CD133+細胞的增殖能力顯著強于CD133-細胞;同時CD133+細胞單克隆形成率也顯著高于CD133-細胞,后者幾乎不能形成典型干細胞球。結(jié)論:經(jīng)含多種生長因子的無血清細胞培養(yǎng)液誘導培養(yǎng),BE(2)-C能夠形成典型的神經(jīng)母細胞瘤干細胞球,其表面高表達CD133蛋白,進一步利用免疫磁珠分選獲得高純度的CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞,初步檢測其增殖能力強。第三部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對神經(jīng)母細胞瘤干細胞生物學特性的影響目的:研究溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對CD133+的神經(jīng)母細胞瘤干細胞的增殖和分化的影響。方法:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24感染CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞,并做如下檢測:Western blotting檢測IL-24蛋白表達,研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞靶向感染和復制能力;MTT實驗檢測溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞的增殖影響;細胞形態(tài)學觀察及western blot檢測Neu N和GFAP的表達,研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞分化的影響;流式細胞分析研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞中CD133表達的影響;裸鼠移植瘤成瘤實驗檢測ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞成瘤能力的影響。結(jié)果:ZD55.F35-IL.24感染CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞高表達IL-24,說明ZD55.F35-IL.24能夠靶向感染CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞并在細胞內(nèi)高效復制表達IL-24蛋白。MTT實驗結(jié)果示溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能夠明顯抑制CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞的增殖。經(jīng)ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞在無血清并添加多種生長因子的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)七天后,細胞形態(tài)變化多樣,突起變細增長;神經(jīng)元標記物Neu N及星形細胞標記物GFAP蛋白的表達明顯增高,而神經(jīng)母細胞瘤干細胞標記物CD133的表達顯著降低,說明ZD55.F35-IL.24能夠誘導神經(jīng)母細胞瘤干細胞分化。經(jīng)ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞裸鼠成瘤能力明顯降低。結(jié)論:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能夠靶向感染CD133+神經(jīng)母細胞瘤干細胞并在細胞內(nèi)高效復制,抑制細胞增殖,誘導細胞分化,降低細胞成瘤能力。這些研究結(jié)果為溶瘤病毒治療神經(jīng)母細胞瘤提供新思路和方法。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

Ad5／F35嵌合增殖型骨架質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35

增殖型穿梭質(zhì)粒pZD55.IL-24

溶瘤病毒 ZD55.F35-IL.24 治療神經(jīng)母細胞三、結(jié) 果鑒定病毒質(zhì)粒骨架質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35Hind III 酶切質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35的DNA，酶切產(chǎn)物瓊示，酶切片段的大小與Hind III酶切位點所含基因片段大-knob5/35正確。

【參考文獻】

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本文編號：2758455