【摘要】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是小兒最常見的顱外腫瘤,起源于腎上腺的腎上嵴,約占小兒所有惡性腫瘤的10%,其惡性程度高,病程進(jìn)展快,多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時已為Ⅲ、Ⅳ期。目前,雖然隨著綜合治療措施(如手術(shù)前的放化療、化療加用造血干細(xì)胞移植等)的實行,但神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治愈率并沒有明顯提高,Ⅳ期患兒的2年生存率僅為19%,而對于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的晚期患兒多在短短數(shù)月內(nèi)死亡。尋找更有效的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療手段是提高其治愈率所急需的。2010年開始,我們利用溶瘤病毒攜帶小干擾RNA或抑癌基因IL-24及IL-24重組蛋白等,研究其對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療作用。結(jié)果顯示IL-24能夠有效抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長、誘導(dǎo)凋亡,同時能夠抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,更感興趣的是我們發(fā)現(xiàn)IL-24重組蛋白能夠誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。研究結(jié)果發(fā)表在Journal of InterferonCytokine Research、tumor Biology、oncology report。本課題擬研究在前期研究溶瘤病毒ZD55-sh MYCN及IL-24治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基礎(chǔ)上,為增強溶瘤病毒靶向感染腫瘤干細(xì)胞能力,用35型腺病毒Fiber的knob結(jié)構(gòu)替換5型腺病毒的knob結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步提高病毒的治療效果,攜帶IL-24基因作為治療基因,構(gòu)建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24。在細(xì)胞和動物水平檢測ZD55.F35-IL.24對神經(jīng)母細(xì)胞瘤-腫瘤干細(xì)胞的治療效果,為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三部分闡述:第一部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24的構(gòu)建及擴(kuò)增純化目的:利用攜帶IL-24基因的溶瘤病毒穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24和Ad5/35嵌合型纖毛的溶瘤病毒骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞包裝成完整的新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并鑒定和擴(kuò)增。方法:將293細(xì)胞鋪于10cm平皿,按細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。將穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24等分別與骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35通過Effectene共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞,9-14天出現(xiàn)病毒空斑,經(jīng)過病毒空斑純化,進(jìn)行擴(kuò)增,提取重組腺病毒的DNA。病毒DNA的抽提按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,獲得重組病毒ZD55.F35-IL.24。通過PCR分別鑒定病毒中是否插入IL-24、及35型Fiber。鑒定正確的病毒分別感染293細(xì)胞,擴(kuò)增病毒,Cs Cl梯度離心法純化病毒,50%組織培養(yǎng)感染量(TCID50)法測病毒滴度。結(jié)果:穿梭質(zhì)粒p ZD55.IL-24等分別與骨架質(zhì)粒p BHGE3-knob5/35通過Effectene共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,病毒空斑純化并擴(kuò)增,獲得重組腺病毒的DNA。以重組病毒基因組為模板PCR擴(kuò)增獲得IL-24基因和Fiber基因,說明溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24重組成功。將ZD55.F35-IL.24感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒,Cs Cl梯度離心純化病毒,-80℃保存?zhèn)溆�。結(jié)論:成功構(gòu)建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并進(jìn)一步擴(kuò)增、純化病毒,為下一步實驗奠定基礎(chǔ)。第二部分神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞BE(2)-C中干細(xì)胞分選、鑒定目的:無血清懸浮培養(yǎng)法和免疫磁珠分選法相結(jié)合從人神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-C細(xì)胞系中誘導(dǎo)培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞并分選鑒定。方法:神經(jīng)母細(xì)胞瘤BE(2)-C細(xì)胞接種于含多種生長因子的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中,通過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得含有大量神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞球。細(xì)胞免疫熒光檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133和Nestin的表達(dá)。進(jìn)一步將干細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液,用CD133標(biāo)記的免疫磁珠對細(xì)胞懸液中的神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞進(jìn)行分選。MTT法和細(xì)胞單克隆形成率實驗檢測分選的CD133+和CD133-的細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果:在含血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)液中,BE(2)-C細(xì)胞貼壁生長,增殖快。在含多種細(xì)胞因子的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中,48小時內(nèi),BE(2)-C細(xì)胞大部分貼壁生長,少部分細(xì)胞呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài)。48小時后,開始形成小細(xì)胞團(tuán)懸浮于培養(yǎng)基中,隨著培養(yǎng)時間延長,細(xì)胞團(tuán)逐漸增大,形成典型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞球。細(xì)胞免疫熒光檢測證明干細(xì)胞球上高表達(dá)CD133和Nestin蛋白。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果示免疫磁珠分選獲得的CD133+細(xì)胞比例達(dá)到93.8%。MTT檢測結(jié)果示CD133+細(xì)胞的增殖能力顯著強于CD133-細(xì)胞;同時CD133+細(xì)胞單克隆形成率也顯著高于CD133-細(xì)胞,后者幾乎不能形成典型干細(xì)胞球。結(jié)論:經(jīng)含多種生長因子的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng),BE(2)-C能夠形成典型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞球,其表面高表達(dá)CD133蛋白,進(jìn)一步利用免疫磁珠分選獲得高純度的CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞,初步檢測其增殖能力強。第三部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響目的:研究溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對CD133+的神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的增殖和分化的影響。方法:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24感染CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞,并做如下檢測:Western blotting檢測IL-24蛋白表達(dá),研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞靶向感染和復(fù)制能力;MTT實驗檢測溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的增殖影響;細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及western blot檢測Neu N和GFAP的表達(dá),研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分化的影響;流式細(xì)胞分析研究ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞中CD133表達(dá)的影響;裸鼠移植瘤成瘤實驗檢測ZD55.F35-IL.24對CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞成瘤能力的影響。結(jié)果:ZD55.F35-IL.24感染CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞高表達(dá)IL-24,說明ZD55.F35-IL.24能夠靶向感染CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制表達(dá)IL-24蛋白。MTT實驗結(jié)果示溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能夠明顯抑制CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的增殖。經(jīng)ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞在無血清并添加多種生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)七天后,細(xì)胞形態(tài)變化多樣,突起變細(xì)增長;神經(jīng)元標(biāo)記物Neu N及星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP蛋白的表達(dá)明顯增高,而神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133的表達(dá)顯著降低,說明ZD55.F35-IL.24能夠誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞分化。經(jīng)ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞裸鼠成瘤能力明顯降低。結(jié)論:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能夠靶向感染CD133+神經(jīng)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞分化,降低細(xì)胞成瘤能力。這些研究結(jié)果為溶瘤病毒治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供新思路和方法。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

Ad5／F35嵌合增殖型骨架質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35

增殖型穿梭質(zhì)粒pZD55.IL-24

溶瘤病毒 ZD55.F35-IL.24 治療神經(jīng)母細(xì)胞三、結(jié) 果鑒定病毒質(zhì)粒骨架質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35Hind III 酶切質(zhì)粒pBHGE3-knob5/35的DNA，酶切產(chǎn)物瓊示，酶切片段的大小與Hind III酶切位點所含基因片段大-knob5/35正確。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2758455