【摘要】：目的:缺血性腦卒中后再灌注損傷引起的血腦屏障(BBB)破壞會(huì)加重水腫,引起進(jìn)一步損傷,是卒中治療中的一大難題。周細(xì)胞作為BBB的重要組成部分,可通過與其他組分相互作用調(diào)節(jié)BBB的結(jié)構(gòu)和功能。以周細(xì)胞為靶點(diǎn)可能為卒中后BBB破壞評(píng)估和治療提供新思路。方法:本研究采用SD大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈栓塞模型(t MCAO)模擬急性缺血性腦卒中及再灌注,通過側(cè)腦室注射miR-149-5p的類似物149-agomir或抑制劑149-antagomir分別上調(diào)或下調(diào)腦梗死周邊區(qū)(IBZ)miR-149-5p水平,采用改良的神經(jīng)功能嚴(yán)重程度評(píng)分(m NSS)評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損情況,采用磁共振(MRI)顯像和伊文氏藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)在體評(píng)估BBB通透性。腹腔注射鞘氨醇-1-磷酸受體(S1PR)2選擇性受體拮抗劑JTE-013抑制S1PR2受體活性。體外采用糖氧剝奪/復(fù)氧模型(OGD/R)模擬缺血缺氧條件,采用S1PR2 si RNA敲除細(xì)胞S1pr2基因表達(dá),使用miR-149-5p類似物mimic或抑制劑inhibior分別上調(diào)或下調(diào)體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)miR-149-5p水平。采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)周細(xì)胞的遷移能力,Transwell體系共培養(yǎng)大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMECs)和腦周細(xì)胞建立體外BBB模型,通過測(cè)量跨內(nèi)皮電阻(TEER)和FITC-葡聚糖通透率評(píng)估體外BBB模型的緊密型和通透性。實(shí)時(shí)-定量PCR(q RT-PCR)方法檢測(cè)大鼠血清、IBZ腦組織和細(xì)胞內(nèi)的miR-149-5p水平及相關(guān)基因m RNA表達(dá)水平。同時(shí)采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種蛋白表達(dá)水平,免疫熒光共聚焦對(duì)S1PR2、PDGFR-β等進(jìn)行定位。采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證S1PR2為miR-149-5p直接靶點(diǎn)。結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn),在體外OGD/R和大鼠tMCAO處理后,腦周細(xì)胞S1PR2的表達(dá)水平顯著增加。MRI顯像和伊文氏藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與溶劑對(duì)照組相比,S1PR2受體拮抗劑JTE-013可明顯減輕t MCAO后大鼠BBB的滲漏;通過檢測(cè)Transwell共培養(yǎng)體系的TEER和FITC-葡聚糖的通透率發(fā)現(xiàn),減少周細(xì)胞S1PR2表達(dá)也可顯著增加體外BBB模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻,減少FITC-葡聚糖滲漏。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)S1PR2可能通過NF-k B p65信號(hào)通路降低周細(xì)胞上N-鈣粘蛋白的表達(dá),同時(shí)促進(jìn)周細(xì)胞遷移。此外,miR-149-5p在t MCAO大鼠IBZ、外周血和OGD/R處理后的周細(xì)胞中顯著下降,其表達(dá)趨勢(shì)與周細(xì)胞上Sl PR2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)S1PR2為miR-149-5p直接靶點(diǎn)。我們進(jìn)一步在體外BBB模型中發(fā)現(xiàn),通過miR-159-5p類似物上調(diào)周細(xì)胞中miR-149-5p水平后,周細(xì)胞上N-鈣粘蛋白表達(dá)水平顯著增加,遷移能力減弱,BBB的通透性降低;而通過miR-159-5p抑制劑下調(diào)周細(xì)胞中miR-149-5p水平后,N-鈣粘蛋白表達(dá)水平明顯降低,遷移能力增強(qiáng),BBB的通透性增加。同時(shí),下調(diào)周細(xì)胞miR-149-5p水平所導(dǎo)致的N-鈣粘蛋白表達(dá)水平的降低,遷移能力的增強(qiáng)和BBB的通透性增加均可通過下調(diào)周細(xì)胞S1PR2的表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。在t MCAO大鼠中,通過側(cè)腦室注射agomir-149-5p上調(diào)miR-149-5p可減輕體內(nèi)BBB通透性并顯著改善t MCAO大鼠的神經(jīng)功能結(jié)局,而下調(diào)miR-149-5p出現(xiàn)相反結(jié)果。結(jié)論:缺血再灌注早期周細(xì)胞上S1PR2受體表達(dá)增加,通過激活NF-k B p65信號(hào)通路減少N-鈣粘蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)周細(xì)胞的遷移,從而加重BBB滲漏,加重?fù)p傷。miR-149-5p可通過直接靶向S1PR2減輕BBB通透性,改善神經(jīng)功能結(jié)局。因此,我們推測(cè),miR-149-5p可能成為缺血性卒中后評(píng)估和治療BBB破壞的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743.3
【圖文】：

導(dǎo)致梗死核心擴(kuò)大[1]。因此本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注在急性缺血再灌注后梗死周邊區(qū)（IBZ）的變化（圖1）。圖 1 模式圖和免疫熒光染色顯示 tMCAO 大鼠 IBZ 部位 標(biāo)尺=50 微米。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文首先為了檢測(cè)急性缺血/再灌后腦內(nèi) IBZ 中 S1PR2 變化規(guī)律，我們采用 qRT-PCR檢測(cè) IBZ 中 S1PR2 mRNA 變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn) S1PR2 在 tMCAO 后 12h 開始表達(dá)增加，到第 1天達(dá)到高峰，持續(xù)增加至第 3 天，然后在第 5 天下降到正常水平（圖 2A）。同時(shí)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示 S1PR2 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)（圖 2B）。

圖 3 tMCAO 后不同時(shí)間點(diǎn) IBZ 中周細(xì)胞 S1PR2 表達(dá)變化 假手術(shù)組和大鼠 tMCAO 后第12 小時(shí)、1 天、3 天、5 天和 7 天后腦切片 S1PR2 和 PDGFR- 雙重免疫熒光染色。標(biāo)尺=20μm。n≥6。

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本文編號(hào)：2758662