【摘要】：目的:1.探討二氯化鈷模擬缺氧微環(huán)境對SHG44膠質(zhì)瘤細胞血管生成擬態(tài)及相關生物學行為(包括增殖、遷移)的影響。2.探討異甘草素對缺氧環(huán)境下SHG44膠質(zhì)瘤細胞血管生成擬態(tài)及相關生物學行為(包括增殖、遷移)的影響。方法:1.第一部分實驗:分別以不同濃度(100、200、400uM)Cocl2作用于SHG44膠質(zhì)瘤細胞24h,采用三維培養(yǎng)檢測膠質(zhì)瘤細胞形成血管生成擬態(tài)能力,應用CCK-8法和劃痕實驗分別檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移能力,采用Western blotting技術檢測EphA2、MMP-2、VEGF等VM相關蛋白表達情況。2.第二部分實驗:氯化鈷模擬缺氧環(huán)境下,分別用低(20uM)、中(40uM)、高(80uM)濃度異甘草素處理SHG44膠質(zhì)瘤細胞24h,采用三維培養(yǎng)檢測膠質(zhì)瘤細胞形成血管生成擬態(tài)能力;應用CCK-8法和劃痕實驗分別檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移能力,采用Western blotting技術檢測EphA2、MMP-2、VEGF等VM相關蛋白表達情況。結果:1.第一部分實驗1.1與空白對照組相比,當二氯化鈷濃度為100uM、200uM時VM數(shù)量、總長度增加,同時,細胞增殖活性及遷移距離增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);當氯化鈷濃度達400uM時,VM數(shù)量、長度減少,細胞增殖活及遷移距離減小;差異具有統(tǒng)計學意(P0.05)。1.2Western blotting結果顯示:與空白對照組相比,濃度為100uM、200uM的二氯化鈷組EphA2、MMP-2、VEGF等VM相關蛋白表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);當氯化鈷濃度達400uM時,EphA2、MMP-2及VEGF蛋白表達降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.第二部分實驗2.1與缺氧空白對照組比較,隨著異甘草素濃度的增加VM數(shù)量、長度明顯減少,細胞增殖活性及遷移距離減小,呈現(xiàn)一定的量效關系,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.2Western blotting結果顯示:異甘草素可以抑制EphA2、MMP-2蛋白的表達,且呈一定的劑量依賴性,即隨著異甘草素濃度增加,EphA2、MMP-2蛋白表達下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。缺氧環(huán)境下,當異甘草素濃度為20uM、40uM時,VEGF蛋白的表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。當異甘草素濃度達80uM時,VEGF蛋白表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.第一部分實驗1.1微缺氧環(huán)境可誘導膠質(zhì)瘤形成VM,同時細胞增殖、遷移能力增加;缺氧程度加重時可抑制VM及相關生物學行為(包括增殖、遷移)。1.2微缺氧可使膠質(zhì)瘤細胞EphA2、MMP-2、VEGF等VM蛋白表達上調(diào):缺氧程度嚴重時抑制EphA2、MMP-2、VEGF蛋白表達。2.第二部分實驗2.1微缺氧環(huán)境下,異甘草素可抑制膠質(zhì)瘤細胞血管生成能力及細胞增殖、遷移能力,其機制可能是通過下調(diào)EphA2、MMP-2、VEGF蛋白的表達。
【學位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.41
【圖文】：

1-5 號管均有 50ul 混合液，6 號管中共 100ul。（4）7 號50ulPBS 緩沖液。（5）稀釋后各 1-7 號 EP 管中標準品蛋50 ug/ml、625 ug/ml、312.5 ug/ml、156.25 ug/ml、78.12液：（1） 按照 BCA 試劑：CU=50:1 的比例配置所需工樣品個數(shù)） 200ul/孔。（標準品個數(shù)=7；二氯化鈷樣品孔中加入 200ul 工作液（注拿 96 孔板時手避免接觸板底（3） 向 7 個標準品孔中依次加入對應的 20ul 前期配好對應的樣品蛋白各 20ul，輕輕搖晃 96 孔板使孔內(nèi)液體混 30min。（4） 取出 96 孔板用酶標儀檢測 562nm 處的吸準品蛋白 OD 值，y 為標準品蛋白濃度)做標準曲線（R2b= -0.3443（表 1）。（5）根據(jù)公式 y=2.1577x-0.3443，已樣品蛋白濃度及上樣量（上樣量=20/蛋白濃度）（圖 1）。

空白對照組細胞無規(guī)律生長序，排列紊亂，僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)網(wǎng)狀結構；Cocl2模擬的缺氧環(huán)境，當濃度為100uM、200uM時可形成較為完整的網(wǎng)狀結構；其中，當Cocl2濃度為200uM時可形成典型的網(wǎng)狀結構；當Cocl2濃度增加到400uM時網(wǎng)狀結構基本消失。（圖2）（3）Image軟件計算各組VM 數(shù)量、長度（表2）：與常氧組對比，濃度為100uM和200uM Cocl2模擬的缺氧環(huán)境下，VM 數(shù)量、長度明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當Cocl2濃度達400uM時VM 數(shù)量、長度較Cocl2濃度200uM時明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。圖2 不同濃度氯化鈷對SHG44膠質(zhì)瘤細胞VM的影響（10 10）

細胞增殖能力呈劑量依賴性增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當氯化鈷濃度達 400uM 時，細胞增殖能力明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（圖 3）圖3 不同氯化鈷濃度對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響2.3缺氧（不同氯化鈷濃度）對SHG44膠質(zhì)瘤細胞遷移的影響細胞劃痕實驗結果顯示：與空白對照組相比， 100uM、200uM 的氯化鈷組細胞遷移距離明顯增加，呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當氯化鈷濃度達 400uM時，細胞遷移距離較 Cocl2 濃度 200uM 明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（圖4）

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本文編號：2758354