【摘要】：既往有很多的文獻(xiàn)研究顯示,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)作為非經(jīng)典IKK激酶的家族一員,其在炎癥性及代謝性疾病中起著重要的作用。近來(lái),IKBKE被認(rèn)為是一種致瘤性的蛋白,其在許多腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象,沉默IKBKE表達(dá)后,腫瘤進(jìn)展會(huì)受到抑制,因此IKBKE在腫瘤靶向治療中成為一個(gè)非常具有潛力的新靶點(diǎn)。作為IKBKE的小分子抑制劑,amlexanox被報(bào)道具有抗炎、抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫功能等作用,已經(jīng)在臨床上應(yīng)用其治療口腔潰瘍、過(guò)敏性哮喘和肥胖等疾病。在本論文中,我們展示了amlexanox具有抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的作用,同時(shí)還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期以及誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡等作用。Amlexanox可以與IKBKE相結(jié)合,調(diào)節(jié)其激酶的活性,降低其蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步的機(jī)制研究則表明,IKBKE與LATS1/2直接結(jié)合,沉默IKBKE可以改變Hippo通路核心蛋白LATS1/2蛋白表達(dá)量,從而激活Hippo通路,抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)展。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下腫瘤和顱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間。這些研究表明amlexanox在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。方法1.首先確定膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U87和U251)在同一時(shí)間不同濃度和同一濃度不同時(shí)間下的存活率(CCK-8實(shí)驗(yàn)),計(jì)算其半數(shù)抑制濃度IC50,從而確定實(shí)驗(yàn)所需的濃度梯度;2.利用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)amlexanox對(duì)腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響;3.利用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)amlexanox對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)amlexanox對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響;4.利用蛋白免疫印跡的方法(western blot,WB)檢測(cè)amlexanox對(duì)U87和U251細(xì)胞IKBKE和Hippo通路核心蛋白表達(dá)量的影響;5.利用WB檢測(cè)沉默(shRNA)和過(guò)表達(dá)(重組質(zhì)粒)IKBKE后,U87和U251細(xì)胞Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白表達(dá)量的變化;6.利用WB及免疫熒光技術(shù)(IF)檢測(cè)沉默IKBKE后,U87和U251細(xì)胞Hippo通路核心蛋白胞漿和胞核內(nèi)的變化;7.利用qRT-PCR檢測(cè)沉默IKBKE后,LATS1/2在轉(zhuǎn)錄水平的變化;利用免疫共沉淀(Co-IP)和WB檢測(cè)IKBKE與LATS1,IKBKE與LATS2是否存在內(nèi)源性結(jié)合,沉默IKBKE后LATS2泛素化水平變化;8.建立裸鼠皮下腫瘤模型(U87細(xì)胞),腹腔內(nèi)注射amlexanox(100mg/kg/day),監(jiān)測(cè)腫瘤體積和裸鼠體重變化,處死裸鼠后,比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量,免疫組化(IHC)檢測(cè)IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的變化;9.利用立體定向技術(shù)將轉(zhuǎn)染了luciferase病毒的U87細(xì)胞注入裸鼠顱內(nèi),建立裸鼠顱內(nèi)腫瘤模型,腹腔內(nèi)注射amlexanox(100mg/kg/day),活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)顱內(nèi)腫瘤體積變化,記錄裸鼠生存時(shí)間,IHC檢測(cè)IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的變化。結(jié)果1.Amlexanox可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及集落形成;2.Amlexanox可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力;3.Amlexanox可以使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期,并且可以誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡;4.Amlexanox可以在轉(zhuǎn)錄后水平影響IKBKE蛋白表達(dá),進(jìn)而改變Hippo通路核心蛋白表達(dá)量及磷酸化狀態(tài);5.IKBKE可以直接與LATS1/2相結(jié)合,沉默IKBKE可以通過(guò)抑制LATS1/2泛素化和降解,從而激活了Hippo通路;6.經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132處理后,IKBKE促進(jìn)LATS1/2降解的過(guò)程受到抑制;7.Amlexanox可以有效抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng),且短期內(nèi)對(duì)裸鼠的體重不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響,IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表達(dá)量減少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表達(dá)量則升高;8.Amlexanox可以有效抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)其生存時(shí)間,IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表達(dá)量減少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表達(dá)量則升高;結(jié)論1.Amlexanox可以有效的抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),降低了IKBKE蛋白表達(dá),改變了Hippo通路核心蛋白表達(dá)量及磷酸化狀態(tài);2.IKBKE可以直接與LATS1/2相結(jié)合,沉默IKBKE抑制了LATS1/2泛素化及降解水平,從而激活了Hippo通路,抑制了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展;3.Amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下腫瘤和顱內(nèi)腫瘤的進(jìn)展,而這主要是通過(guò)抑制IKBKE活性及表達(dá)量,激活Hippo通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4
【圖文】：

大學(xué)博士學(xué)位論文 一、Amlexanox 通過(guò)激活 Hippo 通人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的體外間不同濃度（6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 250 和 300μM）間（24, 48, 72，96h）條件下，處理 U87 和 U251 細(xì)胞。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、Amlexanox 通過(guò)激活 Hippo 通路抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展的體外研究率出現(xiàn)下降，且具有濃度依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)，尤其是在 72 小時(shí)的 IC50 條件下，腫瘤細(xì)胞生存率出現(xiàn)明顯降低。Amlexanox 藥物 72 小時(shí)的 IC50 在 U87 細(xì)胞為133.9±3.035μM，在 U251 細(xì)胞為 114.2±1.462μM。依據(jù)測(cè)得的 amlexanox 的IC50，我們選擇 50、100 和 150μM 作為濃度梯度來(lái)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。1.3.2 Amlexanox 可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力為了研究 amlexanox 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響，我們將 U87和 U251 細(xì)胞接種到 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞為 2000 個(gè)，然后再用不同濃度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μM）進(jìn)行處理，2 周后將形成的細(xì)胞克隆集落進(jìn)行染色并采圖（圖 2），獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖 3）。

3 Amlexanox 抑制 U87 和 U251 細(xì)胞克隆形成的直方圖（*P<0.05，**P<0.01，***P<從上圖分析我們可以看出，amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 細(xì)胞克隆形且具有濃度依賴(lài)性，在 72 小時(shí) IC50 濃度下抑制作用較為明顯。3.3 Amlexanox 可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期阻滯細(xì)胞周期指細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束的周期，反映增殖的速度。為了研究 amlexanox 對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期的影響，我們濃度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μ M）處理 U87 和 U251 細(xì)胞，72 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期變化（圖 4），將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和計(jì)算。在下圖中我們可以看出，amlexanox 可以誘導(dǎo) U87 和 U251 細(xì)胞周期阻滯/G1 期。DNA 復(fù)制所需要的蛋白質(zhì)和 mRNA 的合成以及細(xì)胞體積增長(zhǎng)都 期完成的，說(shuō)明 amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和 mR

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本文編號(hào)：2749536