【摘要】：既往有很多的文獻研究顯示,IKBKE(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon)作為非經(jīng)典IKK激酶的家族一員,其在炎癥性及代謝性疾病中起著重要的作用。近來,IKBKE被認為是一種致瘤性的蛋白,其在許多腫瘤中出現(xiàn)高表達現(xiàn)象,沉默IKBKE表達后,腫瘤進展會受到抑制,因此IKBKE在腫瘤靶向治療中成為一個非常具有潛力的新靶點。作為IKBKE的小分子抑制劑,amlexanox被報道具有抗炎、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫功能等作用,已經(jīng)在臨床上應用其治療口腔潰瘍、過敏性哮喘和肥胖等疾病。在本論文中,我們展示了amlexanox具有抑制膠質母細胞瘤細胞生長、遷移和侵襲的作用,同時還可以誘導腫瘤細胞周期阻滯在G0/G1期以及誘導其發(fā)生細胞凋亡等作用。Amlexanox可以與IKBKE相結合,調(diào)節(jié)其激酶的活性,降低其蛋白表達水平。進一步的機制研究則表明,IKBKE與LATS1/2直接結合,沉默IKBKE可以改變Hippo通路核心蛋白LATS1/2蛋白表達量,從而激活Hippo通路,抑制膠質母細胞瘤發(fā)展。裸鼠體內(nèi)實驗結果進一步顯示amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下腫瘤和顱內(nèi)腫瘤的生長,延長裸鼠的生存時間。這些研究表明amlexanox在治療膠質母細胞瘤中具有重要的應用價值。方法1.首先確定膠質瘤母細胞瘤細胞(U87和U251)在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間下的存活率(CCK-8實驗),計算其半數(shù)抑制濃度IC50,從而確定實驗所需的濃度梯度;2.利用流式細胞儀技術檢測amlexanox對腫瘤細胞周期及凋亡的影響;3.利用細胞克隆形成實驗檢測amlexanox對腫瘤細胞增殖的影響,利用Transwell實驗檢測amlexanox對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響;4.利用蛋白免疫印跡的方法(western blot,WB)檢測amlexanox對U87和U251細胞IKBKE和Hippo通路核心蛋白表達量的影響;5.利用WB檢測沉默(shRNA)和過表達(重組質粒)IKBKE后,U87和U251細胞Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白表達量的變化;6.利用WB及免疫熒光技術(IF)檢測沉默IKBKE后,U87和U251細胞Hippo通路核心蛋白胞漿和胞核內(nèi)的變化;7.利用qRT-PCR檢測沉默IKBKE后,LATS1/2在轉錄水平的變化;利用免疫共沉淀(Co-IP)和WB檢測IKBKE與LATS1,IKBKE與LATS2是否存在內(nèi)源性結合,沉默IKBKE后LATS2泛素化水平變化;8.建立裸鼠皮下腫瘤模型(U87細胞),腹腔內(nèi)注射amlexanox(100mg/kg/day),監(jiān)測腫瘤體積和裸鼠體重變化,處死裸鼠后,比較對照組和實驗組腫瘤重量,免疫組化(IHC)檢測IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的變化;9.利用立體定向技術將轉染了luciferase病毒的U87細胞注入裸鼠顱內(nèi),建立裸鼠顱內(nèi)腫瘤模型,腹腔內(nèi)注射amlexanox(100mg/kg/day),活體成像技術監(jiān)測顱內(nèi)腫瘤體積變化,記錄裸鼠生存時間,IHC檢測IKBKE和Hippo通路核心蛋白及下游靶蛋白的變化。結果1.Amlexanox可以抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖及集落形成;2.Amlexanox可以抑制膠質母細胞瘤細胞的遷移和侵襲能力;3.Amlexanox可以使膠質母細胞瘤細胞阻滯在G0/G1期,并且可以誘導其發(fā)生細胞凋亡;4.Amlexanox可以在轉錄后水平影響IKBKE蛋白表達,進而改變Hippo通路核心蛋白表達量及磷酸化狀態(tài);5.IKBKE可以直接與LATS1/2相結合,沉默IKBKE可以通過抑制LATS1/2泛素化和降解,從而激活了Hippo通路;6.經(jīng)蛋白酶體抑制劑MG132處理后,IKBKE促進LATS1/2降解的過程受到抑制;7.Amlexanox可以有效抑制裸鼠皮下腫瘤的生長,且短期內(nèi)對裸鼠的體重不會產(chǎn)生明顯的影響,IHC檢測發(fā)現(xiàn)Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表達量減少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表達量則升高;8.Amlexanox可以有效抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤的生長,延長其生存時間,IHC檢測發(fā)現(xiàn)Hippo通路核心蛋白YAP1及其下游靶蛋白Axl,c-Myc和Cyr61蛋白表達量減少,而LATS1/2和p-YAP(Ser127)蛋白表達量則升高;結論1.Amlexanox可以有效的抑制膠質母細胞瘤細胞的生長,降低了IKBKE蛋白表達,改變了Hippo通路核心蛋白表達量及磷酸化狀態(tài);2.IKBKE可以直接與LATS1/2相結合,沉默IKBKE抑制了LATS1/2泛素化及降解水平,從而激活了Hippo通路,抑制了膠質母細胞瘤的發(fā)展;3.Amlexanox可以有效的抑制裸鼠皮下腫瘤和顱內(nèi)腫瘤的進展,而這主要是通過抑制IKBKE活性及表達量,激活Hippo通路實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

大學博士學位論文 一、Amlexanox 通過激活 Hippo 通人膠質母細胞瘤進展的體外間不同濃度（6.25, 12.5, 25, 50, 100, 150, 200, 250 和 300μM）間（24, 48, 72，96h）條件下，處理 U87 和 U251 細胞。

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、Amlexanox 通過激活 Hippo 通路抑制人膠質母細胞瘤進展的體外研究率出現(xiàn)下降，且具有濃度依賴和時間依賴，尤其是在 72 小時的 IC50 條件下，腫瘤細胞生存率出現(xiàn)明顯降低。Amlexanox 藥物 72 小時的 IC50 在 U87 細胞為133.9±3.035μM，在 U251 細胞為 114.2±1.462μM。依據(jù)測得的 amlexanox 的IC50，我們選擇 50、100 和 150μM 作為濃度梯度來進行后續(xù)的實驗。1.3.2 Amlexanox 可以抑制膠質母細胞瘤細胞克隆形成能力為了研究 amlexanox 對膠質母細胞瘤細胞克隆形成能力的影響，我們將 U87和 U251 細胞接種到 6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞為 2000 個，然后再用不同濃度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μM）進行處理，2 周后將形成的細胞克隆集落進行染色并采圖（圖 2），獲取實驗數(shù)據(jù)進行分析（圖 3）。

3 Amlexanox 抑制 U87 和 U251 細胞克隆形成的直方圖（*P<0.05，**P<0.01，***P<從上圖分析我們可以看出，amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 細胞克隆形且具有濃度依賴性，在 72 小時 IC50 濃度下抑制作用較為明顯。3.3 Amlexanox 可以誘導膠質母細胞瘤細胞周期阻滯細胞周期指細胞從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束的周期，反映增殖的速度。為了研究 amlexanox 對膠質母細胞瘤細胞周期的影響，我們濃度的 amlexanox（0, 50，100 和 150μ M）處理 U87 和 U251 細胞，72 用流式細胞儀檢測其細胞周期變化（圖 4），將所得數(shù)據(jù)進行分析和計算。在下圖中我們可以看出，amlexanox 可以誘導 U87 和 U251 細胞周期阻滯/G1 期。DNA 復制所需要的蛋白質和 mRNA 的合成以及細胞體積增長都 期完成的，說明 amlexanox 可以抑制 U87 和 U251 細胞周期相關蛋白和 mR

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本文編號：2749536