【摘要】：鐵是維持細(xì)胞功能的重要輔助因子,也是維持神經(jīng)元功能的必需元素,廣泛參與體內(nèi)代謝過(guò)程。然而,研究發(fā)現(xiàn),黑質(zhì)區(qū)鐵聚積參與帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的發(fā)病過(guò)程。但目前鐵選擇性沉積于黑質(zhì)區(qū)的具體原因尚未明確。腦內(nèi)過(guò)量的鐵可以通過(guò)Fenton反應(yīng)與H_2O_2生成大量的OH·,加重細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,腦內(nèi)鐵聚積與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。有證據(jù)表明,L型Ca~(2+)通道(L-type calcium channels,LTCCs)可能介導(dǎo)Fe~(2+)進(jìn)入多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元參與PD發(fā)病過(guò)程,使用LTCCs阻斷劑能延緩PD的發(fā)病;然而,LTCCs參與PD發(fā)病的具體機(jī)制仍不明確。中腦DA能神經(jīng)元存在自主起搏現(xiàn)象,其自主起搏依賴L型Cav1.3型鈣通道。研究還發(fā)現(xiàn),高鐵狀態(tài)下,LTCCs是鐵進(jìn)入心肌細(xì)胞的主要途徑。為探討在PD發(fā)病過(guò)程中,DA能神經(jīng)元上LTCCs是否直接介導(dǎo)Fe~(2+)進(jìn)入細(xì)胞,以及Ca~(2+)對(duì)Fe~(2+)造成的DA能神經(jīng)元毒性的影響及可能機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以DA能MES23.5細(xì)胞和原代培養(yǎng)的腹側(cè)中腦(ventral mesencephalon,VM)神經(jīng)元為觀察對(duì)象,選用小劑量的MPP~+(5μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞24 h,在不同濃度的Fe~(2+)和/或Ca~(2+)作用下,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)水平和線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm)的改變,免疫印跡法檢測(cè)凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)水平,激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)VM神經(jīng)元攝鐵功能的變化以及Fe~(2+)對(duì)VM神經(jīng)元內(nèi)Ca~(2+)濃度的影響,同時(shí)觀察LTCCs阻斷劑伊拉地平對(duì)上述作用的影響。研究結(jié)果如下:1.應(yīng)用Hoechst染色,我們檢測(cè)了MES23.5細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)的變化。與MPP~+組相比,MPP~+/Fe~(2+)共處理組的細(xì)胞核損傷顯著,出現(xiàn)明顯的核固縮、碎裂和染色質(zhì)邊集等凋亡的形態(tài)學(xué)變化(P0.001);而應(yīng)用鈣通道阻斷劑伊拉地平對(duì)Fe~(2+)造成的細(xì)胞核損傷有明顯的保護(hù)作用(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組細(xì)胞的核損傷遠(yuǎn)大于MPP~+/Fe~(2+)共處理組(P0.01);而應(yīng)用鈣通道阻斷劑伊拉地平對(duì)Ca~(2+)和Fe~(2+)共同造成的細(xì)胞核損傷有明顯的保護(hù)作用(P0.01)。2.應(yīng)用MAP2和Hoechst雙染,我們檢測(cè)VM神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)的變化。與MPP~+組相比,MPP~+/Fe~(2+)共處理組的細(xì)胞核損傷數(shù)目增加(P0.001),出現(xiàn)明顯的核固縮、碎裂等;而應(yīng)用伊拉地平對(duì)Fe~(2+)造成的VM神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組的損傷遠(yuǎn)大于MPP~+/Fe~(2+)共處理組(P0.05);而應(yīng)用伊拉地平對(duì)Ca~(2+)和Fe~(2+)共同造成的VM神經(jīng)元的核損傷有明顯的保護(hù)作用(P0.05)。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),我們檢測(cè)了MES23.5細(xì)胞的ΔΨm變化。與MPP~+組相比,Fe~(2+)共孵育可以使ΔΨm降低25%(P0.001);而應(yīng)用伊拉地平能明顯改善Fe~(2+)造成ΔΨm降低的情況(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)處理組的ΔΨm比MPP~+/Fe~(2+)處理組降低12%(P0.05);而應(yīng)用伊拉地平能明顯改善Ca~(2+)和Fe~(2+)造成ΔΨm降低的情況(P0.001)。4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),我們同時(shí)檢測(cè)了VM神經(jīng)元ΔΨm的變化。與MPP~+組相比,MPP~+處理后加Fe~(2+)孵育可以使ΔΨm降低26%(P0.001);而應(yīng)用伊拉地平可改善Fe~(2+)造成VM神經(jīng)元ΔΨm降低的情況(P0.01)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組的細(xì)胞ΔΨm,比MPP~+/Fe~(2+)共處理組降低11%(P0.01);而應(yīng)用伊拉地平能明顯改善Ca~(2+)和Fe~(2+)造成VM神經(jīng)元ΔΨm降低的情況(P0.001)。5.運(yùn)用熒光染料H_2DCF-DA,我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。MPP~+/Fe~(2+)共處理組的細(xì)胞ROS水平約為MPP~+處理組的1.8倍(P0.001);而應(yīng)用伊拉地平可部分阻止Fe~(2+)造成的ROS的升高(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組的細(xì)胞ROS水平約為MPP~+/Fe~(2+)處理組的1.28倍(P0.05);而應(yīng)用伊拉地平可部分阻止Ca~(2+)和Fe~(2+)造成的VM神經(jīng)元內(nèi)ROS水平的升高(P0.001)。6.應(yīng)用western blot,我們檢測(cè)了MES23.5細(xì)胞內(nèi)激活型caspase-3蛋白水平的變化。MPP~+/Fe~(2+)組的激活型caspase-3蛋白的表達(dá)量是MPP~+組的2.3倍(P0.001);而伊拉地平可部分阻斷Fe~(2+)造成的MES23.5細(xì)胞內(nèi)激活型caspase-3蛋白表達(dá)量的增加(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組激活型caspase-3的表達(dá)量是MPP~+/Fe~(2+)共處理組的1.3倍(P0.05);而應(yīng)用伊拉地平能明顯阻斷Ca~(2+)和Fe~(2+)造成MES23.5細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白的激活(P0.001)。7.我們同時(shí)檢測(cè)了VM神經(jīng)元的激活型caspase-3蛋白水平的變化。MPP~+/Fe~(2+)共處理組的激活型caspase-3蛋白水平的表達(dá)量是MPP~+組的3.02倍(P0.001);而應(yīng)用伊拉地平可部分阻斷Fe~(2+)對(duì)VM神經(jīng)元造成的損傷(P0.05)。MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)組的激活型caspase-3的表達(dá)量是MPP~+/Fe~(2+)組的1.59倍(P0.01);而應(yīng)用伊拉地平能明顯阻斷Ca~(2+)和Fe~(2+)造成VM神經(jīng)元內(nèi)caspase-3蛋白的激活(P0.001)。8.5μmol/L MPP~+處理體外培養(yǎng)的VM神經(jīng)元24 h后,應(yīng)用熒光染料calcein作為指示劑,利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)VM神經(jīng)元的攝鐵能力,其熒光越強(qiáng),攝鐵能力越弱。結(jié)果顯示,使用100μmol/L FeSO_4灌流,與對(duì)照組相比,VM神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度降低,表明其攝鐵能力增加;當(dāng)灌流液中加入10μmol/L伊拉地平后,與MPP~+組相比,VM神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度增加,表明其攝鐵能力減弱;當(dāng)灌流液中加入10μmol/L的Bayk8644后,與MPP~+處理組相比,VM神經(jīng)元的攝鐵能力明顯增強(qiáng)。9.利用激光共聚焦顯微鏡,我們進(jìn)一步檢驗(yàn)了Fe~(2+)對(duì)VM神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度是否有影響。與對(duì)照組相比,MPP~+、MPP~+/Ca~(2+)(2.5 mmol/L)共處理組的胞內(nèi)Ca~(2+)水平隨著時(shí)間的推移,并沒(méi)有發(fā)生大幅度的變化。與MPP~+組相對(duì)比,MPP~+/Fe~(2+)處理組會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)Ca~(2+)的小幅度升高。與MPP~+/Fe~(2+)組相比,增大細(xì)胞外Ca~(2+)的濃度(增大至2.5 mmol/L),胞內(nèi)Ca~(2+)濃度大幅升高;同時(shí)加入鈣通道阻斷劑伊拉地平能阻斷胞內(nèi)Ca~(2+)濃度的升高。綜上所述,阻斷或激活LTCCs,可改變神經(jīng)元鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,即LTCCs可以介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞內(nèi)增加的鐵可以導(dǎo)致細(xì)胞ΔΨm降低,ROS水平升高,最終激活caspase-3途徑引起細(xì)胞的凋亡。并且,MPP~+/Ca~(2+)/Fe~(2+)共處理組比MPP~+/Fe~(2+)處理組對(duì)細(xì)胞的損傷顯著增強(qiáng),而MPP~+/Ca~(2+)組未對(duì)細(xì)胞造成明顯損傷,提示細(xì)胞外高Ca~(2+)可顯著加重Fe~(2+)的毒性作用。這可能是因?yàn)檫M(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的Fe~(2+)造成鈣通道的持續(xù)開(kāi)放,Ca~(2+)內(nèi)流增加造成鈣超載,也可能是由于游離Ca~(2+)升高加劇了Fe~(2+)的毒性造成的。應(yīng)用鈣通道阻斷劑伊拉地平對(duì)Fe~(2+)造成的細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。本研究為探索PD發(fā)病過(guò)程中LTCCs的作用及LTCCs介導(dǎo)鐵聚積的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5
【圖文】：

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果1. 免疫熒光技術(shù)鑒定原代培養(yǎng)的 VM 神經(jīng)元純度應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，鑒定原代培養(yǎng)的 VM 神經(jīng)元的純度。通過(guò)計(jì)數(shù)熒光圖像中 MAP2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和圖像中的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，以確定培養(yǎng)的 VM 神經(jīng)元的純度。MAP2 是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物。通過(guò)計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示 MAP2 的陽(yáng)性率在 90%以上。

不同處理組MES23.5細(xì)胞核形態(tài)的改變Fig.2.1MorphologicalchangesinthenucleiofMES23.5cellswithdifferenttreatmentsHoechst33258fluorescentdyestainingwasusedtoobservethenuclearmorphologyinMES23.5cells.A.MorphologicalchangesinthenucleiofMES23.5cells(400×).Incontrolgroup,MPP+groupandMPP+/Ca2+group,thenucleiofMES23.5cellswereroundandlarge.CellsinMPP+/Fe2+groupandMPP+/Ca2+/Fe2+groupexhibitedhyper-cond

圖 2.2 不同處理組 VM 神經(jīng)元細(xì)胞核形態(tài)的改變Fig.2.2 Morphological changes in the nuclei of VM neurons with different treatmentshe nuclear morphological changes of VM neurons were detected by MAP2 and Hoechst doutaining. A. Morphological changes in the nuclei of VM neurons (400×). White arrow indicates yper-condensed nuclear and fragmentation of chromatin. B. Summarized data showed the numbersondensed nuclei in different treatment groups. Compared with MPP+group, the numbers ondensed nuclei in MPP+/Fe2+group and MPP+/Ca2+/Fe2+group increased significantly. Isradiponferred on a significant protection against the damage in VM neurons induced by Fe2+. The numbf condensed nuclei of MPP+/Ca2+/Fe2+group were more than that in MPP+/Fe2+group, and ifference was statistically significant. Isradipine may partly protect against both Ca2+and Fnduced damage in VM neurons. The data were presented as mean ± S.E.M. of 6 independxperiments. (***P<0.001, compared with the MPP+group;#P<0.05, compared with MPP+/Fe2+groP<0.05, compared with MPP+/Ca2+/Fe2+group).3. 不同處理組 MES23.5 細(xì)胞和 VM 神經(jīng)元 ΔΨm 的變化ΔΨm是反映線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，與凋亡密切相關(guān)。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢胞內(nèi)ΔΨm的變化，觀察MPP+預(yù)處理后Ca2+/Fe2+共處理對(duì)MES23.5細(xì)胞ΔΨm的++2+

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本文編號(hào)：2748631