發(fā)布時間：2020-07-08 08:45

【摘要】：研究背景腦卒中是由腦血管堵塞或破裂導致腦供血不足而引發(fā)的一系列腦組織缺血缺氧性改變,是最常見的中樞神經系統(tǒng)疾病之一,具有高致死率、致傷率和致殘率的特點。隨著社會老齡化的加劇,腦卒中已成為60歲以上人群的首位致死性疾病~([1,2]),其中缺血性腦卒中占該類疾病的80%~([3])。據(jù)報道,超過2/3的腦卒中患者飽受卒中后遺癥的折磨~([4])。運動功能障礙、學習記憶能力損傷、失語癥等卒中后遺癥不僅嚴重影響患者的生活質量~([5]),對社會和家庭也造成了沉重的經濟負擔。目前,雖然靜脈注射纖溶酶原激活劑和血管內介入取栓等方法在缺血性腦卒中治療方面表現(xiàn)出了較好的療效,但是由于治療時間窗(卒中發(fā)生后4.5 h內)的嚴格限制~([6,7]),對很多患者并不適用。其他治療方式~([8])如:亞低溫腦保護,腦水腫脫水治療、神經營養(yǎng)因子治療和改善微循環(huán)等對癥支持治療,只能減輕繼發(fā)腦損傷,對已形成的損傷和神經功能缺失療效有限。干細胞移植技術雖然在基礎和臨床研究中被證實具有促進組織修復的巨大潛力~([9-12]),但在實際應用中因存在免疫排斥、移植后存活率低、致瘤等問題~([13]),限制了其臨床轉化和推廣應用。研究發(fā)現(xiàn),內源性神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)在腦損傷后會出現(xiàn)增殖,但增殖水平有限,尚無法實現(xiàn)神經組織再生和功能重建~([14])。因而,如何促進損傷后體內固有的NSCs增殖、遷移和定向分化,已經成為神經再生和腦損傷修復領域的研究熱點。經顱直流電刺激(Transcranial direct current stimulation,tDCS)是利用恒定、低強度直流電(≤2 mA)調節(jié)大腦皮層神經元電活動的一種物理治療技術,具有操作簡單、安全、無創(chuàng)等優(yōu)勢。最新研究顯示~([15,16]),tDCS對腦卒中后運動功能障礙的康復具有顯著促進作用,但因機制尚不明確,限制了其向臨床應用轉化。因此,本課題以國際公認的缺血性腦卒中動物模型為研究對象,評價了tDCS對運動功能障礙康復的促進作用并從神經再生和神經保護兩個方面探討了其作用機制。研究目的明確tDCS對運動功能障礙康復的促進作用,并初步闡明其作用機制,為tDCS的臨床轉化和推廣應用提供理論和實驗依據(jù)。第一部分tDCS的生物安全性研究材料與方法1.動物分組:健康成年雄性SD大鼠24只,隨機分為對照組(Control,n=12)和經顱直流電刺激組(tDCS,n=12)。2.刺激電極植入與tDCS處理:2.1大鼠經1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,切開頭部皮膚、去除皮下組織后充分暴露顱骨,將自制杯狀刺激電極(接觸面積3.5mm~2)通過骨水泥固定于右側初級運動皮層M1區(qū)對應的顱骨表面,坐標位置為:AP+2.0 mm,ML+2.0 mm。2.2實施tDCS處理時,首先將杯狀刺激電極內注入生理鹽水,然后與直流電刺激儀相連,參照電極(圓型橡皮板電極,接觸面積為7.0 cm~2)固定于動物胸部。tDCS組大鼠接受兩個階段的陰極tDCS處理(電流強度500μA,15 min/次,1次/d),每個階段5 d,兩階段間隔2 d。Control組大鼠僅與刺激儀相連,但無電流輸出。整個刺激過程中實驗動物處于清醒狀態(tài)。3.檢測方法:通過計算機模擬仿真技術研究tDCS過程中電流密度在頭部的分布情況;采用曠場、轉棒、水迷宮等行為學實驗方法研究tDCS對健康大鼠腦功能的影響;利用血液學、血生化、形態(tài)學、神經遞質檢測和腦溫監(jiān)測等方法評價tDCS的神經毒性和對大鼠一般健康狀況的影響。研究結果1.電流密度分布情況:不同組織中電流密度分布存在較大差異,其中腦組織的電流密度為20 A/m~2,顱骨電流密度為40-60 A/m~2。2.行為學檢測結果:與Control組相比,tDCS組大鼠在曠場內的總運動距離和轉棒停留時間均無明顯差異;在水迷宮實驗中,兩組動物達到平臺潛伏期和目標象限停留時間無明顯差異。上述結果表明,本實驗條件下的tDCS對健康大鼠運動功能和學習記憶能力無明顯影響。3.形態(tài)學、血液學和血生化檢測結果:HE染色結果顯示,與Control組相比,tDCS組大鼠重要臟器(心、肺、肝、脾、腎)的形態(tài)結構無明顯改變。血液學檢測結果顯示,兩組大鼠血常規(guī)指標無明顯差異。血生化檢測結果顯示,兩組大鼠血清肝、腎功能指標無顯著差異。上述結果表明,本實驗條件下的tDCS對健康大鼠重要臟器的形態(tài)結構及造血、肝腎功能無明顯影響。4.腦組織形態(tài)、神經遞質及腦溫檢測結果:腦組織HE和尼氏染色結果顯示,與Control組相比,tDCS組大鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經細胞的形態(tài)結構及尼氏體的形態(tài)和密度無顯著改變。液質聯(lián)用法對大鼠大腦皮層和海馬組織神經遞質的檢測結果顯示,Control組和tDCS組之間沒有顯著差異。此外,熱成像儀的檢測結果顯示,與Control組相比,tDCS組大鼠腦溫沒有明顯改變。上述結果表明,本實驗條件下的tDCS對健康大鼠不會產生神經毒性。第二部分tDCS對缺血性腦卒中導致的大鼠運動功能障礙康復的促進作用研究材料與方法1.刺激電極植入手術:健康成年雄性SD大鼠175只,經1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,切開頭部皮膚、去除皮下組織后充分暴露顱骨,將自制杯狀刺激電極(接觸面積3.5 mm~2)通過骨水泥固定于右側初級運動皮層M1區(qū)對應的顱骨表面,坐標位置為:AP+2.0 mm,ML+2.0 mm。2.缺血性腦卒中模型建立和分組:植入刺激電極的SD大鼠,經1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后,充分暴露右側頸總動脈,游離頸內動脈與頸外動脈,于頸外動脈遠心端剪一缺口,將硅膠頭端尼龍栓線經頸外動脈缺口—頸內、頸外動脈分岔口—頸內動脈顱底段插至大腦中動脈起始段,阻塞大腦中動脈(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)血流2 h后拔出栓線制成大鼠缺血性腦卒中模型,即MCAO模型,隨后通過Zea longa評分從117只MCAO模型大鼠中篩選出62只中度腦損傷大鼠并隨機分兩個實驗組:MCAO手術+tDCS治療組(MCAO+tDCS,n=32)和MCAO手術+假tDCS治療組(MCAO+Sham,n=30);另外58只植入電極的大鼠接受假MCAO手術,即僅暴露頸部血管并縫合,之后隨機分為兩個對照組:Control+tDCS組(n=29)和Control+Sham組(n=29)。3.tDCS處理:MCAO術后第二天(2-day post MCAO operation,POD 2)實施tDCS,方法同第一部分。4.檢測方法:采用曠場、轉棒、足跡分析等行為學實驗,檢測大鼠在MCAO手術前行為數(shù)據(jù)的基線水平,之后每兩天檢測一次,以評價tDCS對MCAO大鼠運動功能障礙康復的促進作用。研究結果1.tDCS對缺血性腦卒中大鼠自發(fā)運動功能康復的影響:曠場實驗結果顯示,與兩個Control組相比,MCAO組大鼠在曠場內的總運動距離顯著降低(P0.05)。與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠在曠場內的總運動距離顯著增加(P0.05)。Control+Sham組和Control+tDCS相比,曠場內運動總距離無明顯差異。2.tDCS對缺血性腦卒中大鼠運動耐力康復的影響:轉棒實驗結果顯示,MCAO組大鼠在轉棒上的停留時間較兩個Control組顯著縮短(P0.01)。tDCS連續(xù)治療5d后,MCAO+tDCS組大鼠在轉棒上的停留時間明顯延長,與MCAO+Sham組相比有顯著差異(P0.01)。Control+Sham組和Control+tDCS相比,大鼠轉棒停留時間無明顯差異。3.tDCS處理對缺血性腦卒中大鼠跛行步態(tài)康復的影響:足跡分析結果顯示,與兩個Control組相比,MCAO組大鼠患肢足底面積和步幅均顯著降低(P0.01),tDCS治療后,MCAO+tDCS組大鼠患肢步幅和足底面積康復速度明顯加快,與MCAO+Sham組相比有顯著差異(P0.05)。Control+Sham組和Control+tDCS相比,大鼠足跡分析結果(足底面積和步幅)無明顯差異。第三部分tDCS對缺血性腦卒中大鼠神經發(fā)生的影響及信號通路研究材料與方法1.用于第二部分實驗的SD大鼠在行為學實驗結束后進行第三部分實驗研究。2.檢測方法:在MCAO術后第3天(POD 3)利用2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色檢測腦組織缺血損傷面積;在POD 3和POD 7,通過免疫熒光組織化學染色(Immunofluorescence staining confocal,IFC)技術研究tDCS治療對NSCs增殖、遷移和分化的影響;在POD 14,利用透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM)和蛋白電泳(Western blot,WB)實驗檢測有髓神經纖維數(shù)量、厚度和髓鞘相關蛋白的表達;通過IFC和WB實驗檢測tDCS治療對NSCs的Notch1通路相關蛋白表達和分布的影響。研究結果1.tDCS對缺血損傷側室管膜下區(qū)(Subependymal region,SVZ)NSCs增殖和遷移的影響:TTC染色和IFC結果顯示,在POD 3,MCAO+tDCS組大鼠梗死的紋狀體內出現(xiàn)了大量Nestin~+細胞(NSCs的標志物),與MCAO+Sham組相比差異具有顯著性(P0.01)。兩個Control組動物的紋狀體中未觀察到Nestin~+細胞。IFC結果顯示,在POD 3和POD 7,MCAO組大鼠SVZ區(qū)Nestin~+/Ki67~+細胞百分比與兩個Control組相比顯著增加(P0.01);tDCS處理后,MCAO+tDCS組大鼠SVZ區(qū)Nestin~+/Ki67~+細胞百分比較MCAO+Sham組顯著增加(P0.01)。Nestin~+細胞計數(shù)結果顯示,MCAO+tDCS組大鼠SVZ區(qū)Nestin~+細胞數(shù)量與兩個Control組相似,但顯著低于MCAO+Sham組(P0.01)。MCAO+tDCS組大鼠梗死的紋狀體內Nestin~+細胞數(shù)量顯著增加,與MCAO+Sham組相比有顯著差異(P0.01)。Control+Sham組和Control+tDCS組大鼠SVZ區(qū)Nestin~+/Ki67~+細胞百分比和NSCs數(shù)量均無明顯差異。2.tDCS處理后缺血損傷側紋狀體中NSCs的分化情況:IFC、WB和TEM檢測結果顯示,缺血損傷側紋狀體中出現(xiàn)的NSCs可以向神經元和少突膠質細胞分化,與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠缺血損傷側紋狀體中由NSCs分化來的未成熟神經元、成熟神經元和少突膠質細胞數(shù)量明顯增多。Control+Sham組和Control+tDCS組動物的紋狀體中幾乎沒有觀察到NSCs和未成熟的神經元。3.tDCS處理后缺血損傷側紋狀體中Notch1通路激活情況:與Control+Sham組相比,MCAO+Sham組大鼠缺血損傷側紋狀體中配體DLL1、活化狀態(tài)的Notch1(NICD)和靶基因Hes1的表達顯著增高(P0.01);與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組動物缺血損傷側紋狀體中Jagged1,DLL1,NICD和Hes1表達顯著降低,Notch1負性調控因子NUMB表達顯著增高(P0.01),提示tDCS治療可以顯著抑制MCAO大鼠缺血損傷側紋狀體中Notch1信號通路的激活。IFC共定位結果顯示,與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組動物缺血損傷側紋狀體中Nestin~+/Hes1~+雙標細胞百分率明顯降低(P0.01),提示tDCS主要抑制了缺血損傷側紋狀體中NSCs的Notch1通路。Control+Sham組和Control+tDCS組未觀察到Nestin~+/Hes1~+雙標細胞。第四部分tDCS對缺血性腦卒中大鼠的神經保護作用研究材料與方法1.手術與動物分組:電極植入和MCAO手術按照第二部分實驗所述進行,55只符合實驗要求的MCAO大鼠隨機分兩個實驗組:MCAO+tDCS組(n=27)和MCAO+Sham組(n=28);另外54只植入電極的大鼠接受假腦缺血手術,之后隨機分為兩個對照組:Control+tDCS組(n=27)和Control+Sham組(n=27)。2.tDCS處理:從POD 2開始對tDCS組動物施加tDCS處理,具體步驟按照第二部分實驗所述進行。3.檢測方法:采用體重監(jiān)測、改良神經功能缺損評分(Modified neurological severity score,mNSS)評價tDCS對缺血性腦卒中大鼠一般健康狀況和神經功能缺損的改善效果;利用TTC染色檢測梗死面積;利用HE染色和Nissl染色檢測缺血損傷側腦組織形態(tài)結構;通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中神經元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)含量和腦組織缺血半暗帶(Cerebral ischemic penumbra,CIP)中白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1?(Interleukin-1?,IL-1?)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)和腫瘤壞死因子-?(Tumor necrosis factor-?,TNF-?)的含量;利用IFC和WB方法檢測星形膠質細胞和小膠質細胞的活化情況;通過WB和轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(Terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色檢測tDCS處理后CIP的細胞凋亡情況。研究結果1.tDCS處理對缺血性腦損傷大鼠體重和神經功能的影響:與兩個Control組相比,MCAO組大鼠體重顯著降低(P0.05),tDCS處理5 d后,MCAO+tDCS組大鼠體重增加明顯,與MCAO+Sham組相比具有顯著差異(P0.05),并且該差異的一直持續(xù)至POD 14。mNSS結果顯示,與兩個Control組相比,MCAO手術后,大鼠的mNSS顯著升高;tDCS處理5 d后,MCAO+tDCS組大鼠的mNSS較MCAO+Sham組顯著降低(P0.05),在POD 14,MCAO+tDCS組的mNSS仍低于MCAO+Sham組。Control+Sham組和Control+tDCS組大鼠體重和mNSS無明顯差異。2.tDCS對缺血性腦卒中大鼠腦損傷程度的影響:TTC染色結果顯示,與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠腦梗死面積和腦水腫分數(shù)均顯著降低(P0.01);ELISA實驗結果顯示,與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠血清NES含量顯著降低(P0.05)。上述檢測指標在Control+Sham組和Control+tDCS組中無顯著差異。3.tDCS對缺血性腦卒中大鼠損傷側腦組織形態(tài)結構的影響:兩個Control組大鼠皮層中神經元和膠質細胞的形態(tài)結構及尼氏體的形態(tài)和密度均無顯著差異。與兩個Control組相比,MCAO手術組動物在缺血性腦卒中早期(POD 3)損傷側大腦皮層形態(tài)結構發(fā)生明顯改變,主要表現(xiàn)為:皮層神經元數(shù)目減少且排列紊亂,伴局部變性及壞死,尼氏體數(shù)量明顯減少(P0.01)。與MCAO+Sham組性比,MCAO+tDCS組大鼠損傷側大腦皮層組織結構比較完整,尼氏體數(shù)量明顯增加(P0.01),提示tDCS可以保護缺血性腦卒中早期腦組織的形態(tài)結構。4.tDCS對缺血性腦卒中大鼠損傷側腦組織中膠質細胞的影響:IFC和WB檢測結果顯示,在POD 3,MCAO組大鼠CIP中膠質纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)和離子鈣接頭蛋白抗原(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,IBA-1)陽性細胞數(shù)量和蛋白表達水平均顯著增加,與兩個Control相比具有顯著差異(P0.05);與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠CIP中星形膠質細胞和小膠質細胞數(shù)量顯著減少、胞體顯著縮小,GFAP和IBA-1蛋白表達顯著降低(P0.01)。Control+Sham組和Control+tDCS組大鼠CIP中星形膠質細胞和小膠質細胞的形態(tài)與GFAP和IBA-1的蛋白水平均無顯著差異。5.tDCS對缺血性腦卒中大鼠損傷側腦組織中炎癥因子水平的影響:ELISA檢測結果顯示,與兩個Control組相比,MCAO組大鼠CIP中促炎因子IL-6、IL-1?、TNF-?的含量和抑炎因子IL-10的含量均顯著升高(P0.01);與MCAO+Sham組相比,MCAO+tDCS組大鼠CIP中上述促炎因子的含量顯著降低(P0.05),抑炎因子的含量顯著升高(P0.01)。Control+Sham組和Control+tDCS組大鼠CIP中上述檢測指標無顯著差異。6.tDCS對缺血性腦卒中大鼠損傷側腦組織細胞凋亡的影響:TUNEL染色和WB檢測結果顯示,與Control+Sham組相比,在POD 3,MCAO+Sham組大鼠CIP中凋亡細胞百分比顯著增加(P0.05),凋亡相關蛋白Caspase 3表達水平顯著增高(P0.01);tDCS處理后,MCAO+tDCS組大鼠CIP中凋亡細胞百分比和Caspase 3表達水平較MCAO+Sham組均顯著降低(P0.01)。研究結論1本實驗條件下的tDCS對大鼠重要臟器(腦、心、肺、肝、脾、腎)的形態(tài)結構和功能無明顯影響,提示電流強度500μA,刺激時長15 min/次的陰極tDCS對大鼠是安全的。2本實驗條件下的tDCS可促進缺血性腦卒中大鼠運動功能障礙的康復。3本實驗條件下的tDCS可通過調節(jié)NSCs的增殖、遷移和分化,促進缺血性腦卒中大鼠的神經發(fā)生,Notch1通路可能參與了對NSCs分化過程的調控。4本實驗條件下的tDCS可明顯減輕缺血性腦卒中早期的腦損傷程度,并改善其神經功能,其機制可能與tDCS抑制神經炎癥反應和細胞凋亡有關。5 tDCS促進缺血性腦卒中大鼠運動功能康復的機制可能與tDCS調控神經發(fā)生和發(fā)揮神經保護作用有關。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

圖 1 自制杯狀刺激電極（A）杯狀刺激電極模式圖；（B）杯狀刺激電極俯視圖；（C）杯狀刺激電極剖視圖。2.2 刺激電極植入手術實驗開始前三天，實施刺激電極植入手術（實驗流程見圖 2）。動物經 1%戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上。碘伏消毒皮膚后于頭頂部做一橢圓形切口，去除皮下組織并以 30%雙氧水清除顱骨表面殘余結締組織，充分暴露顱骨及冠狀縫、矢狀縫等骨性標志。利用微型鉆在目標腦區(qū)（右側初級運動皮層 M1 區(qū)）對應顱骨表面周圍鉆孔并擰入不銹鋼顱釘，為后期杯狀刺激電極的固定做好準備。顱釘以擰入顱骨后不晃動，同時不損傷腦組織為宜。之后將自制杯狀刺激電極（接觸面積 3.5mm2）固定于腦立體定位儀懸臂，調節(jié)電極位置并將其放置于右側初級運動皮層 M1 區(qū)對應的顱骨表面（坐標位置：AP + 2.0 mm, ML + 2.0 m），最

（A）杯狀刺激電極模式圖；（B）杯狀刺激電極俯視圖；（C）杯狀刺激電極剖視圖。2.2 刺激電極植入手術實驗開始前三天，實施刺激電極植入手術（實驗流程見圖 2）。動物經 1%戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上。碘伏消毒皮膚后于頭頂部做一橢圓形切口，去除皮下組織并以 30%雙氧水清除顱骨表面殘余結締組織，充分暴露顱骨及冠狀縫、矢狀縫等骨性標志。利用微型鉆在目標腦區(qū)（右側初級運動皮層 M1 區(qū)）對應顱骨表面周圍鉆孔并擰入不銹鋼顱釘，為后期杯狀刺激電極的固定做好準備。顱釘以擰入顱骨后不晃動，同時不損傷腦組織為宜。之后將自制杯狀刺激電極（接觸面積 3.5mm2）固定于腦立體定位儀懸臂，調節(jié)電極位置并將其放置于右側初級運動皮層 M1 區(qū)對應的顱骨表面（坐標位置：AP + 2.0 mm, ML + 2.0 m），最后通過骨水泥和顱釘將電刺激極長期固定于實驗動物頭部（圖 3）。

圖 3 刺激電極植入手術過程（A）動物固定與皮膚消毒；（B）暴露顱骨與骨性標志；（C）在目標腦區(qū)對應的顱骨表面周圍鉆孔；（D）固定不銹鋼顱釘；（E）放置杯狀刺激電極；（F）用骨水泥和顱釘固定刺激電極。2.3 施加 tDCS刺激前，利用備皮器除去實驗動物胸部毛發(fā)，生理鹽水濕潤裸露皮膚、束身衣固定參照電極（圓型橡皮板電極，接觸面積為 7.0cm2）（圖 4A）。然后將杯狀刺激電極內注滿生理鹽水，隨后將電極與電路連接頭螺旋固定（圖 5）。tDCS 時，將刺激電極與直流電刺激儀（圖 4B）相連。tDCS 組大鼠接受兩個階段的陰極 tDCS（500μA，15min/次，1 次/d），每個階段 5d，兩階段間隔 2d（圖 2）。Control 組大鼠僅與刺激儀相連，但無電流輸出。整個刺激過程中實驗動物處于清醒狀態(tài)（圖 4C），

【參考文獻】

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本文編號：2746339