【摘要】：目的:周圍神經(jīng)損傷是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,損傷后修復(fù)治療的效果欠佳。因此,尋找改善周圍神經(jīng)損傷修復(fù)效果的新方法一直是臨床焦點(diǎn)問(wèn)題之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類多能干細(xì)胞,最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn),具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn),MSCs能分泌多種生長(zhǎng)因子,以內(nèi)分泌和旁分泌的方式促進(jìn)組織修復(fù),具有保護(hù)腎臟,減輕心肌缺血/再灌注損傷,也具有治療腦中風(fēng)和阿爾茨海默病的潛能,同時(shí)具有促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)等作用。外泌體(Exosome)是一種可由活性細(xì)胞分泌的納米級(jí)脂質(zhì)雙層囊泡物質(zhì),含有某些生物活性分子(如siRNA、mRNA以及多種蛋白)。骨髓MSCs可產(chǎn)生豐富的外泌體,MSCs源性外泌體能模擬某些MSCs的生物學(xué)功能,逐漸被證實(shí)具有促進(jìn)組織修復(fù)作用。MSCs促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)作用是否與其分泌的外泌體有關(guān),少有文獻(xiàn)報(bào)道。本文主要探討MSCs源性的外泌體是否具有促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生作用及其效果,并對(duì)修復(fù)過(guò)程中的機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法:建立SD大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)壓榨(Crush)模型,模型大鼠的右側(cè)腓腸肌分別注射PBS、外泌體、MSCs。(1)在術(shù)前和術(shù)后的14 d、術(shù)后28 d,分別進(jìn)行步態(tài)分析,計(jì)算坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI);熱板實(shí)驗(yàn)測(cè)定熱痛潛伏期。(2)術(shù)后14 d和28 d,取壓榨位點(diǎn)近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)干,甲苯胺藍(lán)染色計(jì)算遠(yuǎn)端神經(jīng)再生的有髓纖維數(shù)量和直徑。(3)術(shù)后14 d和28 d,取壓榨位點(diǎn)遠(yuǎn)端神經(jīng)干,免疫組化法觀察S-100和NGF蛋白的表達(dá)改變。(4)術(shù)后7 d用Q-PCR方法檢測(cè)提取DRG的Akt1、NGFr、PMP22、S100B、VEGFA和HGF基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)術(shù)后14 d和28 d,外泌體組和MSCs組大鼠的右后肢的運(yùn)動(dòng)功能、紅腫程度和各腳趾伸展程度均明顯好于PBS組。SFI和熱痛潛伏期的恢復(fù)程度,外泌體組和MSCs組顯著好于PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。其中術(shù)后14 d、28 d SFI值外泌體組優(yōu)于MSCs組。(2)術(shù)后14 d和28 d,外泌體組和MSCs組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量、直徑均明顯優(yōu)于PBS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),術(shù)后14 d和28 d外泌體組神經(jīng)纖維數(shù)量多于MSCs組(p0.05)。(3)術(shù)后14 d和28 d,外泌體組和MSCs組S-100和NGF表達(dá)均比PBS組高(p0.05)。(4)術(shù)后7 d外泌體組和MSCs組DRG中PMP22、VEGFA、NGFr及S100B的mRNA表達(dá)水平升高(p0.05)。結(jié)論:(1)MSCs源性的外泌體能促進(jìn)周圍神經(jīng)神經(jīng)再生,其效果不亞于MSCs。(2)MSCs源性的外泌體可促進(jìn)周圍神經(jīng)S-100B、NGFr、PMP-22、VEGFA的表達(dá)增高。
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R745
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)方法1 MSCs 和外泌體的提取及鑒定本研究實(shí)所用的 MSCs 和外泌體來(lái)源于課題組前期研究。首先我們?cè)隗w養(yǎng)出純化 MSCs 細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè) MSCs 成對(duì)標(biāo)記物 CD44/CD成功提取 MSCs。隨后我們使用第 6 代 MSCs 提取外泌體，在透射電鏡實(shí)了我們成功在 MSCs 中提取到外泌體，微流式檢測(cè)的外泌體濃度3×109個(gè)/ml（圖 1）。外泌體提取方法：MSCs P6 細(xì)胞在 T175 細(xì)胞瓶生匯合，PBS 漂洗 3 次，每次用 35 ml PBS，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 ml。經(jīng)歷72 h的無(wú)血清培養(yǎng)，搖晃幾次后，收集上清用于提取外泌體。30 10 min，去除活細(xì)胞。留取上清。2000×g，離心 10 min，去除死細(xì)胞。1000離心 30 min，去除細(xì)胞碎片。留取上清。用 0.22 um 的一次性針頭過(guò)濾菌。用Macrosep 超濾管將上清液濃縮至 9 ml 左右。100,000×g 離心 70 m200 ul PBS 重懸外泌體沉淀。-80oC 保存。

大鼠能夠在通道里連續(xù)行走，保證實(shí)驗(yàn)的順28 d 分別步態(tài)測(cè)定。SFI 的具體測(cè)定方法格為長(zhǎng) 80 cm 、寬 10 cm 高 15 cm，兩端開(kāi)寬后鋪于槽底（圖 2-2），遠(yuǎn)端放一暗箱。肢雙腳踝關(guān)節(jié)著色后，放于槽的開(kāi)口端，端行走，每側(cè)后肢各留下 4~5 個(gè)足印，選擇側(cè)足（E）的 3 個(gè)指標(biāo)測(cè)量：①足印長(zhǎng)度從足跟到足尖的距離；②足趾寬度（width1 趾到第 5 趾連線距離；③中間足趾距離（連線距離（如圖 2-1）。將上述3 變量代入)/NPL+109.5(ETW-NTW)/-NTW+13.3(EIT-N代表假手術(shù)側(cè)。公式計(jì)算結(jié)果 0%～-11%能完全喪失，-11%～-100%表示部分神經(jīng)功

圖 2-2 步態(tài)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)Figure 2-2 Gait experiment sceTL）測(cè)定 d、21d、28 d 分別進(jìn)行熱板一個(gè)透明觀測(cè)柱狀體，熱板透明觀測(cè)柱里，用秒表計(jì)時(shí)足記為大鼠的熱刺激縮足為避免組織損傷，每次時(shí)量 3 次，取平均值評(píng)估熱痛潛

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本文編號(hào)：2746303