發(fā)布時(shí)間：2020-07-02 19:02

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,約占整個(gè)顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的40%-50%,本研究中的大腦半球膠質(zhì)瘤約占全部膠質(zhì)瘤的51%左右。以腫瘤細(xì)胞的來源分類,腦膠質(zhì)瘤以星型細(xì)胞瘤為最多,其次是少突膠質(zhì)瘤和少突星型細(xì)胞瘤。以星型細(xì)胞瘤的惡性程度又可將其劃分為I,II,III,IV四個(gè)級別,其中I級為星型細(xì)胞瘤,II級為浸潤型細(xì)胞瘤,III級為間變型細(xì)胞瘤,IV級為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,是惡性程度最高的一種腦膠質(zhì)瘤。惡性膠質(zhì)瘤年發(fā)病率約為5/100,000,每年新發(fā)病例超過14,000例,65歲以上常見。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力很強(qiáng)又加之腫瘤病灶位于大腦這個(gè)關(guān)鍵區(qū)域,患者預(yù)后較差,當(dāng)前的IV級膠質(zhì)瘤平均生存期為14.6月,臨床治療難度很高[1-3]。研究已知膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵原癌基因?yàn)閏-Myc。一般認(rèn)為遺傳因素是導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的重要原因之一[4-5],并且近幾年研究者們發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在多種類型的腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá),這種高表達(dá)導(dǎo)致的異常的組蛋白甲基化修飾往往能夠引起靶基因表達(dá)活性的改變,從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。而下調(diào)G9a蛋白的表達(dá)或是G9a蛋白特異性小分子抑制劑的應(yīng)用則會引起腫瘤細(xì)胞的增殖抑制、遷移侵襲能力減弱以及自噬等現(xiàn)象的產(chǎn)生[6-8]。雖然關(guān)于組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中作用的研究已有報(bào)道,但有關(guān)G9a蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原癌基因c-Myc之間相互作用的機(jī)制研究卻幾乎沒有。因此本研究著眼于探究組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲和自噬過程的影響以及其對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原癌基因c-Myc的調(diào)控機(jī)制,以期能為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新思路。以下是本論文的主要發(fā)現(xiàn):1.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與成瘤我們采用Western blot技術(shù)檢測到G9a蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中普遍高表達(dá)。接著我們利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA干涉技術(shù)以及G9a蛋白的特異性抑制劑BIX01294,在LN-229和U-87 MG細(xì)胞系中分別對G9a蛋白的表達(dá)進(jìn)行了下調(diào)以及功能抑制。CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)以及Ki67細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示,G9asi和被BIX01294處理過的細(xì)胞的增殖能力都明顯受到抑制且細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞增殖過程被抑制在了G2期。接著Western blot結(jié)果顯示G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中與增殖相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量均下調(diào)。接著軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞的體外克隆形成能力均明顯下降。最后我們通過建立荷瘤鼠模型,發(fā)現(xiàn)G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力均減弱。分析在R2-微陣列分析和可視化平臺在線數(shù)據(jù)庫中里搜索的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a的表達(dá)量與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存時(shí)間的關(guān)系數(shù)據(jù)得出,G9a蛋白的表達(dá)量越高,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后效果相應(yīng)越差。以上現(xiàn)象說明組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖以及成瘤的過程中發(fā)揮著積極的作用。2.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移侵襲首先我們進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞其遷移能力明顯減弱。接著我們進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn),結(jié)果再一次顯示G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞其遷移侵襲能力明顯減弱。最后我們采用Western blot技術(shù)檢測了G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中與遷移侵襲相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示這些蛋白的表達(dá)量均發(fā)生了明顯的下調(diào)。以上現(xiàn)象說明組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移侵襲的過程中發(fā)揮著積極的作用。3.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬我們在顯微鏡下觀察到G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯變化,即大量的小囊和液泡聚集在細(xì)胞核周圍,在形態(tài)學(xué)上與自噬小體的結(jié)構(gòu)非常相似。接著共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中,LC3B陽性斑的數(shù)量明顯增加。最后我們采用Western blot技術(shù)檢測了G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中與自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示這些蛋白的表達(dá)量均發(fā)生了明顯的變化。以上現(xiàn)象說明下調(diào)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a的表達(dá)量或是抑制其功能,均能誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。4.組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄過程c-Myc在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中被證實(shí)為重要的原癌基因。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果預(yù)測:當(dāng)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a蛋白的功能被抑制時(shí),細(xì)胞中c-Myc基因的表達(dá)活性會被明顯抑制。接著我們利用了Western blot技術(shù)檢測到在G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中,c-Myc蛋白的表達(dá)量確實(shí)明顯下調(diào)。接著我們在G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc。體外層面,我們通過CCK8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,相比較未過表達(dá)c-Myc前,細(xì)胞的增殖能力得到了一定恢復(fù);通過軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,相比較未過表達(dá)c-Myc前,細(xì)胞的克隆形成能力也得到了一定恢復(fù)。然后我們進(jìn)行了共聚焦實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示細(xì)胞中LC3B陽性斑的數(shù)量明顯減少,即相比較未過表達(dá)c-Myc前,細(xì)胞的自噬現(xiàn)象得到了一定緩解。體內(nèi)層面,我們通過建立荷瘤鼠模型發(fā)現(xiàn),相比較未過表達(dá)c-Myc前,細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力同樣也得到了一定恢復(fù)。接著我們利用Western blot技術(shù)檢測到在G9asi細(xì)胞以及被BIX01294處理過的細(xì)胞中過表達(dá)c-Myc后,細(xì)胞中與增殖和自噬相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量同樣得到了一定恢復(fù)。最后基于以上現(xiàn)象,我們進(jìn)行了ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果顯示G9a蛋白與c-Myc啟動子區(qū)域直接結(jié)合,暗示組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a可直接調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄過程,從而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤整個(gè)發(fā)生發(fā)展的過程。綜上所述,組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、成瘤、遷移侵襲以及自噬過程都具有重要作用;組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a可以直接通過調(diào)控膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原癌基因c-Myc的轉(zhuǎn)錄過程來影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的整個(gè)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。本研究結(jié)果以期為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床治療提供新策略,同時(shí)豐富該疾病的理論研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4
【圖文】：

Seminarsin Cell&Developmental Biology,2009,21(2):209-220圖 1.1 近 40 年有關(guān)組蛋白甲基化與癌癥相關(guān)的研究 1.1 Published papers of histone methyltransferases related 學(xué)的內(nèi)容包括組蛋白修飾、DNA 甲基化、RNA 編飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用已經(jīng)得到了研究

Pulmonary Circulation,2011,1(3):34圖 1.2 表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象包括組蛋白修飾，RNA 干涉，DNA 甲基Epigenetics includes histone modification, RNA interference and DN

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2738561