【摘要】：膠質瘤作為中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,不僅發(fā)病率日趨增高,且患者預后極差,以美國腦腫瘤中心統(tǒng)計結果為例,膠質瘤經過系統(tǒng)治療后5年以內的生存率僅為10～20%。根據(jù)膠質瘤細胞的分化特征和組織病理學特征,WHO中樞神經系統(tǒng)腫瘤分型有4個級別,Ⅰ級膠質瘤患者的預后較好。Ⅱ級膠質瘤預后不良,但可以存活很長時間。而Ⅲ級,如星形細胞瘤,又或Ⅳ級的膠質母細胞瘤,均具有分化程度低,高度侵襲且極易復發(fā),故歸為高級別膠質瘤。除了上述臨床已廣泛應用的分類方法,根據(jù)分子病理學特征能更精確對膠質瘤細胞的生物功能進行分類。目前膠質瘤的分子病理分型方法主要有美國TCGA膠質瘤四分類法和中國CGGA,其中CpG島甲基化(CpG island methylation)、EGFRvⅢ擴增(EGFRvⅢamplification)、MGMT啟動子甲基化(MGMT promotor methylation)、PTEN突變(PTEN mutation)、TP53突變(TP53 mutation)、BRAF融合和突變(BRAF fusion and mutation)等分子指標已用于臨床檢測,這些腫瘤的特征性標志物雖然可以指導治療并預測療效,但其影響生物表型機制的研究呈碎片化,未能構建完整的交通網絡,為了解決這一問題,以高通量微陣列芯片測序技術為代表的第二代測序技術應運而生,改變了以往針對DNA分子測序不及時不全面的問題,單次既可完成數(shù)百萬條序列的完整測定,由此產生了海量的生物信息學數(shù)據(jù)成為人類基因組計劃啟動的原始基礎。與此同時,通過交叉利用遺傳學、分子生物學、數(shù)學、統(tǒng)計學以及計算機編程等多門學科的技術,針對海量的數(shù)據(jù)進行分類整理,最終發(fā)展出生物信息學(Bioinformatics),并建立了包括TCGA、KEGG等多個數(shù)據(jù)庫,用于腫瘤分析標志物的篩查,深度解析腫瘤細胞生物學功能的作用機制,服務于全球科研工作者。TCGA數(shù)據(jù)庫由美國國家衛(wèi)生研究院發(fā)起的公共資助項目,是全世界最大規(guī)模的基因工程成果,旨在通過大規(guī)模基因組測序和多維分析,對人類腫瘤群體的主要致癌基因進行研究和分類,并免費向全球腫瘤研究人員提供不同級別數(shù)據(jù),從經過處理的Level 3數(shù)據(jù)(如處理過的基因甲基化的β數(shù)據(jù)),到Level 1未處理的原始數(shù)據(jù)集(如450K甲基化芯片原始數(shù)據(jù)),均可通過官方工具或R軟件、perl軟件等不同方式下載;除了涵蓋mRNA、lncRNA、miRNA以及甲基化等不同類型的表達數(shù)據(jù)之外,TCGA數(shù)據(jù)庫還針對每一種疾病、每一個樣本進行了嚴格的隨訪,并整理成完整數(shù)據(jù)集以供查閱。通過綜合分析TCGA內表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),可為研究者在篩選研究目標基因、進行對照分析、驗證實驗結果等不同領域提供詳實可靠的數(shù)據(jù)。KEGG數(shù)據(jù)庫由日本京都大學生物信息中心建立并管理,此數(shù)據(jù)庫主要涉及基因組破譯方面研究,結合基因組學、生物化學、生物信息學等方面的研究,把已經完成測序的基因序列與細胞的生物學功能進行系統(tǒng)關聯(lián),建立起人類基因表達調控的完整網絡。整個KEGG數(shù)據(jù)庫內包含十幾個不同的子數(shù)據(jù)庫,子數(shù)據(jù)庫間內容相互關聯(lián)印證,不但包含了幾乎所有的信號通路的信息,還將信號通路與所含的每一個基因、調控的功能和涉及的疾病集中整合,以圖文并茂的形式展現(xiàn)給研究者,是研究信號通路相關信息中最為重要的數(shù)據(jù)庫。本研究中,通過這TCGA、KEGG和GTEx等多個數(shù)據(jù)庫內膠質瘤的相關信息進行進行生物信息學分析,對特異性表達基因進行大規(guī)模篩查,并深入研究影響基因表達的機制,構建跨基因、跨通路的表達調控網絡,深度解析潛在的抑癌、促癌基因影響膠質瘤生物學功能的機制,尤其是特定基因或基因集的表達變化對信號通路狀態(tài)或生物表型的影響研究。目的:1.基于生物信息學方法對膠質瘤中特異性生物標志物進行大規(guī)模篩查,探索生物信息學在膠質瘤生物功能分析中的應用。2.探討GALNT7在膠質瘤中的差異性表達及其對膠質瘤細胞生物學功能的影響;3.探討膠質瘤中MRC2甲基化水平對表達的影響,分析MRC2甲基化水平和mRNA表達間的調控關系,預測兩者對膠質瘤細胞生物學功能的影響。方法:1.基于R X64 3.4.1軟件下載TCGA數(shù)據(jù)庫內膠質瘤相關mRNA和Clinical數(shù)據(jù),通過基因差異性表達分析初步篩選出在膠質瘤中呈差異性表達的目標基因:多肽n-乙酰半乳糖基轉移酶7(polypeptide N-acetyl galactosaminyl transferase 7,GALNT7)和甘露糖受體C2(mannose receptor C type 2,MRC2)。2.對GALNT7和MRC2 mRNA表達量進行單因素方差分析和多重比較,檢驗GALNT7和MRC2在不同級別膠質瘤和正常腦組織內表達的差異性。3.以TCGA數(shù)據(jù)庫內GALNT7和MRC2在膠質瘤組織內的表達量中位值為標準,將GALNT7和MRC2在膠質瘤內的表達量分為高、低表達組,通過t檢驗分析GALNT7MRC2 mRNA表達量的變化與臨床特征的相關性,同時采用Kaplan-Meier生存分析探討GALNT7和MRC2表達量的變化對無瘤生存期(Disease-Free Survival,DFS)和總體生存期(Overall Survival)間的影響。4.以TCGA數(shù)據(jù)庫內GALNT7和MRC2表達的中位值為標準,將膠質瘤內GALNT7和MRC2 mRNA表達量的數(shù)據(jù)分為高、低表達組。從分子特征數(shù)據(jù)庫(Molecular Signatures Database,MsigDB)下載參考集2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt,根據(jù)缺省加權富集法,隨機組合的數(shù)量定為1000次,名義P值(Nominal P-values,NOMP)0.05,錯誤發(fā)現(xiàn)率(False Discovery Rates,FDR)0.25。結合KEGG數(shù)據(jù)庫內信號通路的資料,使用GSEA3.0軟件進行基因富集分析。根據(jù)富集分析結果,探討GALNT7和MRC2高表達狀態(tài)所激活的信號通路對膠質瘤細胞生物學功能的影響,進而深度解析GALNT7和MRC2差異性表達對膠質瘤預后的影響機制。5.聯(lián)合分析TCGA 數(shù)據(jù)庫內GBM和LGG的Illumina Human Methylation 450 BeaChip數(shù)據(jù)和mRNA Counts數(shù)據(jù),分析基因甲基化和表達之間的關系,最終確定以MRC2甲基化及其啟動子(Promoter)區(qū)域和第一內含子(First intron,Intron 1)區(qū)域內位點甲基化作為研究目標,并結合TCGA內GBM和LGG的Clinical數(shù)據(jù),整體分析MRC2甲基化和位點甲基化水平對mRNA表達和生存期的影響。6.通過臨床手術收集樣本,包括膠質瘤Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級腫瘤組織以及正常腦組織,同時培養(yǎng)膠質瘤細胞株U373和A172。所有臨床樣本經HE染色后,在電鏡下根據(jù)病理學特征進行分級;以正常腦組織作為對照組,行免疫組化實驗和Western Blot實驗,觀察GALNT7和MRC2在正常腦組織、不同級別膠質瘤和膠質瘤細胞株中表達的情況。結果:1.通過差異性表達分析TCGA內膠質瘤mRNA表達數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)GALNT7和MRC2在膠質瘤中均呈高表達,且表達量在GBM中表達最高,LGG中次之,正常腦組織中最少(P0.05);臨床相關性分析提示性別對GALNT7表達水平無影響(P=0.82),年齡、腫瘤分級均影響其表達,且和生存狀態(tài)相關(P0.05);MRC2表達水平與性別無關(P=0.516),但與年齡、腫瘤分級和生存狀態(tài)有關(P0.05);GALNT7和MRC2高表達的膠質瘤患者的DFS和OS 比低表達的膠質瘤患者縮短(P0.05)。2.針對GALNT7的基因集富集和皮爾森系數(shù)(r)進行基因相關分析表明,高表達的GALNT7可能通過與5個共表達基因共同調節(jié)5條信號通路,進而影響膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力,其中影響增殖的基因和信號通路包括:RAC1調節(jié)的NK細胞介導的細胞毒性信號通路、PVR調節(jié)的CAMs信號通路、TNC調節(jié)的ECM-receptor interaction作用信號通路;影響侵襲的基因和信號通路包括:Crk調節(jié)的肌動蛋白細胞骨架信號通路和STAT3調節(jié)的JAK-STAT信號通路。差異分析顯示Crk、RAC1、STAT3和TNC表達與膠質瘤的惡性程度呈正相關。PVR在GBM中高表達,而在LGG中表達低于正常腦組織(P0.05)(圖6)。生存分析顯示,RAC1、STAT3、PVR和TNC的表達與無瘤生存期(Disease-Free Survival,DFS)呈負相關,而與Crk的表達無明顯相關性。Crk、RAC1、STAT3、PVR、TNC的表達水平與總生存期(Overall Survival,OS)呈負相關(P0.05)3.針對MRC2的基因集富集和皮爾森系數(shù)(r)進行基因相關分析表明,高表達MRC2可通過7個共表達基因激活7條重要的信號通路,進而影響膠質瘤細胞的增殖和侵襲。其中影響增殖的途徑包括:NOTCH3參與調節(jié)的NOTCH信號通路,MYD88參與調節(jié)的TLRs信號通路,HLA-A參與調節(jié)的NK細胞介導的細胞毒性信號通路和STAT3參與調節(jié)的JAK-STAT信號通路;影響侵襲的途徑包括MSN激活的肌動蛋白細胞骨架信號通路,CD276參與的CAMs信號通路以及TNC調節(jié)的ECM-receptor interaction信號通路。差異分析顯示NOTCH3、MYD88、MSN、HLA-A、STAT3、CD276和TNC表達與膠質瘤的惡性程度呈正相關(P0.05)。生存分析顯示,NOTCH3、MYD88、MSN、HLA-A、STAT3、CD276和TNC的表達水平與DFS和OS呈負相關(P0.05)。5.通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫下載GBM和LGG的Illumina Human Methylation 450數(shù)據(jù)進行差異性表達分析,我們發(fā)現(xiàn)膠質瘤中MRC2甲基化水平較正常腦組織降低(P0.05);MRC2甲基化水平與MRC2的表達呈負相關(P0.05);1個位于Promotor區(qū)域的CpG位點(cg14764661)和8個位于Intron 1區(qū)域的CpG位點(cg00679546、cg05651778、cg11628739、cg24368031、cg13659446、cg14237903、cg16200799、cg17226280)的甲基化水平與MRC2的表達呈負相關;結合生存分析,膠質瘤中MRC2表達增高與其低甲基化狀態(tài)相關,且MRC2低甲基化合并高表達狀態(tài)的患者生存期會相應縮短。4.免疫組化實驗證明,GALNT7和MRC2在GBM、LGG和正常腦組織中呈差異性表達(P0.05),兩者在GBM中表達最高,LGG中表達次之,正常腦組織中表達最低,這說明GALNT7和MRC2表達量與惡性程度呈正相關。此外,Western Blot實驗檢測正常腦組織、Ⅲ級膠質瘤病人樣品及膠質瘤細胞株(U373、A172)中MRC2的表達量,結果發(fā)現(xiàn),與正常腦組織樣品組相比,MRC2在Ⅲ級膠質瘤病人樣品及膠質瘤細胞株中的表達量明顯上調,結果存在統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論:通過分析TCGA、KGEE和GTEx為代表的大數(shù)據(jù)庫內膠質瘤相關數(shù)據(jù),可對膠質瘤特異性生物標志物進行大規(guī)模篩查。以此為基礎篩選出的在膠質瘤中特異性高表達的基因GALNT7和MRC2,可通過多條信號通路影響膠質瘤細胞的增殖、侵襲等生物學功能,并最終影響患者預后,可作為膠質瘤的早期檢測、診斷和治療的特異性生物學標志物。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.4
【圖文】：

圖２．差異性表達基因篩選：Ａ．膠質瘤中ｍＲＮＡ差異性表達基因火山圖；Ｂ．膠逡逑質瘤中ｍＲＮＡ差異性表達基因熱圖

圖４．免疫組化結果提示ＧＡＬＮＴ７在正常腦組織（Ａ）內表達低，ＩＩＩ級（Ｃ）、ＩＶ級（Ｄ）中表達依次增高，這說明表達量與腫瘤級別呈正尸＜０．０５），差異存在統(tǒng)計學意義。逡逑

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡建宏;王茂林;潘亞文;;高遷移率族蛋白B1在膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究[J];國際神經病學神經外科學雜志;2019年02期

2 楊海霞;李曉鳴;;外泌體與膠質瘤關系的研究進展[J];臨床與病理雜志;2017年11期

3 秦麗娟;賈永森;趙喜慶;張?zhí)?張偉;孫娜;;鴉膽子油乳注射液對膠質瘤細胞侵襲性的影響及其可能機制[J];四川大學學報(醫(yī)學版);2016年03期

4 齊玲;徐俊杰;紀朋艷;呂士杰;韓磊;王瑋瑤;;西蘭花多肽抑制膠質瘤細胞生長的機制研究[J];中國藥學雜志;2014年12期

5 萬政強;陳晨;伏林山;孫關;;吡格列酮對膠質瘤細胞生長的抑制研究[J];東南大學學報(醫(yī)學版);2013年01期

6 李嗍,王楓,繆珊,駱文靜;過量鋅對鼠膠質瘤細胞體外生長的影響[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2001年04期

7 楊偉廉,王堯,韋永新,阮長耿,杜子威;抗膠質瘤細胞單克隆抗體SZ-38及其識別抗原的生化特征[J];生物化學雜志;1988年06期

8 斯可哉;;在體外和體內用利血平調節(jié)C_6膠質瘤細胞亞系對ACNU的抗藥性[J];國外醫(yī)學(腫瘤學分冊);1988年02期

9 楊偉廉;抗膠質瘤細胞單克隆抗體SZ—38及其識別抗原的生化特征[J];蘇州醫(yī)學院學報;1989年01期

10 李方園;高翼之;王世浚;;四種人癌基因在腦瘤中的擴增和重排(摘要)[J];鐵道醫(yī)學;1989年01期

相關會議論文 前10條

1 楊鵬宇;李強;張建生;;雷帕霉素聯(lián)合尼莫司汀抑制膠質瘤細胞的研究[A];2011中華醫(yī)學會神經外科學學術會議論文匯編[C];2011年

2 俞文華;車志豪;張祖勇;許培源;陸鏞民;傅林;朱強;陳鋒;杜權;;骨橋蛋白在膠質瘤細胞中的表達及其信號傳導途徑[A];2005年浙江省神經外科學術會議論文匯編[C];2005年

3 潘冬生;;多基因修飾膠質瘤細胞疫苗的抗腫瘤免疫反應[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

4 張玉寶;孫金龍;孟祥靖;魏麟;劉廣存;崔友強;;膠質瘤細胞中VEGF、MMP-2、MMP-9的表達及臨床觀察[A];中華醫(yī)學會神經外科學分會第九次學術會議論文匯編[C];2010年

5 趙世光;;膠質瘤細胞周期動力學研究[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經外科醫(yī)師分會成立大會資料匯編[C];2004年

6 張瑞;胡佩珊;臧清策;岳小飛;周幟;徐曉宇;韓為;張瑞萍;再帕爾·阿不力孜;;基于液相色譜-質譜聯(lián)用技術的膠質瘤細胞代謝組學分析[A];中國化學會第十一屆全國生物醫(yī)藥色譜及相關技術學術交流會（大會特邀報告及墻報）論文摘要集[C];2016年

7 宋楊英;劉英姿;單保恩;;IL-18基因轉染對大鼠9L膠質瘤細胞生長特性的影響[A];中華醫(yī)學會第九次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術會議論文匯編[C];2011年

8 楊孔賓;趙世光;劉炳學;陳曉豐;戴欽舜;;K~+通道阻斷劑四乙胺對大鼠膠質瘤細胞的增殖和凋亡影響[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

9 李格;黃益玲;;MiR-19a靶向LRIG1對腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展的影響[A];中國生物化學與分子生物學會第十二屆全國會員代表大會暨2018年全國學術會議摘要集[C];2018年

10 李子超;姜東伯;楊舒雅;王靜;孫元杰;趙國慶;楊琨;;B細胞受體相關蛋白31對膠質瘤細胞行為的影響[A];第十一屆全國免疫學學術大會摘要匯編[C];2016年

相關重要報紙文章 前2條

1 特約記者 李岳冰;中國膠質瘤放療專家共識發(fā)布[N];健康報;2018年

2 張獻懷　張文;瘤區(qū)埋雷 持續(xù)殺傷[N];健康報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 孫超;消癌解毒方中有效成分抗腫瘤的作用機制研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2019年

2 封林森;miR-330-5p靶向ITGA5抑制膠質母細胞瘤的惡性表型及其機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2019年

3 苗發(fā)安;DKC1在膠質瘤中的表達及其對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2019年

4 張開鑫;MiR-940通過MTHFD2基因影響膠質瘤細胞的代謝、增殖和侵襲能力及其機制的研究[D];南京醫(yī)科大學;2019年

5 常成岳;TRIM37在人腦膠質瘤中的表達及對膠質細胞生物學影響的實驗研究[D];山東大學;2019年

6 華實;基于生物信息學分析高表達GALNT7和MRC2對膠質瘤細胞增殖、侵襲性的影響[D];山東大學;2019年

7 肖瑾;多模態(tài)MRI在人腦膠質瘤病理分級、基因型及其預后評估中的應用[D];安徽醫(yī)科大學;2018年

8 尤昕;Nexilin表達下調對膠質瘤細胞生物學特性的影響及機制研究[D];延邊大學;2015年

9 鄧鑫;HAX-1蛋白通過Akt1通路對膠質瘤細胞增殖和調亡的影響及機制研究[D];鄭州大學;2018年

10 唐純海;miR-130a調控靶基因HMGB2抑制膠質瘤增殖和EMT的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 宋亞男;炎癥對膠質瘤細胞中線粒體生物學性能的影響[D];鄭州大學;2019年

2 譚呼;膠質瘤患者血清MAGE-D4蛋白和抗體的檢測及臨床意義分析[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

3 鄔慧賢;miR-200a靶向抑制MAGED4及其對膠質瘤遷移侵襲的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

4 王修成;人腦膠質瘤組織中IDH-1和MGMT的表達及相關性研究[D];鄭州大學;2019年

5 劉暢;膠質瘤中啟動子甲基化和轉錄因子Sp1對MAGE-D4的轉錄調控作用[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

6 吳明娜;ATF5在神經膠質瘤中的表達及預后意義[D];遵義醫(yī)科大學;2019年

7 古禹;Per2基因過表達對U87膠質瘤干細胞放療敏感性影響的研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2019年

8 郭忠yN;膠質瘤分子標志物IDH1、MGMT和Ki-67與預后關系的研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2019年

9 馬寧飛;導航輔助波譜與病理結合指導功能區(qū)膠質瘤切除及術后放化療[D];寧夏醫(yī)科大學;2019年

10 仇誠;MicroRNA-155在膠質瘤中的作用及其機制[D];南京醫(yī)科大學;2019年

本文編號：2738302