【摘要】：目的:MicroRNA-155(miR-155)在免疫和炎癥過程中起著重要作用,但目前尚不清楚miR-155介導(dǎo)的炎癥是否參與了癲癇的發(fā)生,本論文通過海人酸(KA)誘導(dǎo)的癲癇動(dòng)物和細(xì)胞模型,來研究miR-155在癲癇疾病過程中的作用,并進(jìn)一步在癲癇患者的血液中來驗(yàn)證動(dòng)物模型的結(jié)果,希望探索新的生物標(biāo)志物來解決臨床問題。方法:采用KA腹腔注射的C57BL/6小鼠癲癇模型和KA處理的原代細(xì)胞癲癇模型,運(yùn)用腦電圖監(jiān)測(cè)、側(cè)腦室立體定位、提取蛋白質(zhì)和RNA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、原代細(xì)胞培養(yǎng)、Fluoro-Jade B(FJB)染色等大量實(shí)驗(yàn)來研究miR-155的表達(dá)水平、分布、靶基因等,并在癲癇患者的血液中,提取miRNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR來驗(yàn)證miR-155的表達(dá)。結(jié)果:在成功的癲癇小鼠模型中,miR-155在癲癇小鼠海馬中的表達(dá)較對(duì)照組(Ctrl組)顯著升高,腦電圖顯示實(shí)驗(yàn)組(KA組)小鼠出現(xiàn)的癲癇波改變明顯,側(cè)腦室注射miR-155拮抗劑(miR-155 antagomir)后,我們發(fā)現(xiàn)KA+ antagomir組腦電圖的癲癇波出現(xiàn)頻率和幅度較KA組降低,在FJB染色中,KA組較對(duì)照組CA2區(qū)神經(jīng)元變性數(shù)量多,KA+ antagomir組神經(jīng)元變性壞死數(shù)目減少;在成功的癲癇細(xì)胞模型中,miR-155在膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)比在神經(jīng)元中的高,在小膠質(zhì)細(xì)胞中,用50μM的KA處理的時(shí)間梯度中,miR-155的表達(dá)顯著上調(diào),且通過多個(gè)預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Csflr隨著時(shí)間梯度變化顯著下調(diào),KA+antagomir組Csflr蛋白表達(dá)水平較Ctrl組上調(diào);在癲癇患者血液中,與健康對(duì)照組相比,miR-155表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論:MiR-155通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞參與炎癥促進(jìn)癲癇的發(fā)生,靶基因?yàn)镃sflr;應(yīng)用miR-155 antagomir可減輕癲癇發(fā)作、改善腦電圖放電現(xiàn)象、減少神經(jīng)元受損;血液中miR-155水平可能是癲癇潛在的生物標(biāo)志物,而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中miR-155的表達(dá)可能是癲癇的治療策略。
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

笫三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析逡逑第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析逡逑３．１邋ｍｉＲ－１５５水平在ＫＡ誘導(dǎo)的癩癇發(fā)作小鼠中升高逡逑將海人酸按１５ｍｇ／ｋｇ的劑量給實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射，對(duì)照組則相同劑量腹腔注逡逑射生理鹽水，癲癇發(fā)作后按Ｒａｃｉｎｅ分級(jí)選擇實(shí)驗(yàn)需要的小鼠（癲癇小鼠３只，逡逑對(duì)照小鼠３只），２４小時(shí)后心臟灌流，取小鼠的海馬和皮層，提�。遥危粒ㄟ^實(shí)逡逑時(shí)定量ＰＣＲ邋（邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋）來檢測(cè)處理后的小鼠的大腦中的逡逑ｍｉＲ－１５５／ｍｉＲ－２００ｂ／ｍｉＲ－２３ａ的表達(dá)水平。內(nèi)參基因?yàn)椋眨叮瑢?shí)驗(yàn)中的ｍｉＲＮＡ擴(kuò)增逡逑曲線平滑，溶解曲線僅有一個(gè)溶解峰，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ＫＡ處理后皮逡逑層和海馬中ｍｉＲ－１５５的水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑ＡＢ逡逑

腦中不同神經(jīng)細(xì)胞類型中的表達(dá)情況，我們用５０＾Ｍ濃度的ＫＡ處理細(xì)胞后，逡逑用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法來驗(yàn)證表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１５５在小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠逡逑質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)比在神經(jīng)元中豐富（圖３．４Ａ）。此外，在富含ｍｉＲ－１５５的小膠逡逑質(zhì)細(xì)胞中，觀察隨著時(shí)間梯度中ｍｉＲ－１５５的表達(dá)情況（圖３．４Ｂ），以此發(fā)現(xiàn)相關(guān)逡逑性來預(yù)測(cè)靶基因，ｍｉＲ－１５５表達(dá)隨著時(shí)間推移升高。有文獻(xiàn)顯示［５°］，ｍｉＲ－１５５靶逡逑基因可能為Ｃｓｆｌｒ、Ｔｌｒ６、Ｃ８ｏｒｆ４、Ｐｅａｌ５ａ等，我們用ｑＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)對(duì)這些預(yù)測(cè)逡逑靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性驗(yàn)證，觀察ｍＲＮＡ水平的變化，因?yàn)椋恚椋遥危翆?duì)于靶基因的調(diào)逡逑控均是負(fù)向調(diào)控，所以隨著時(shí)間關(guān)系，靶基因的表達(dá)是下調(diào)的，在篩選的多個(gè)預(yù)逡逑測(cè)靶基因中，我們猜測(cè)Ｃｓｆｌｒ可能為ｍｉＲ－１５５的靶基因（圖３．４Ｃ）。逡逑己用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法驗(yàn)證Ｃｓｆｌｒ?yàn)椋恚椋遥保担档陌谢颍又ㄟ^細(xì)胞轉(zhuǎn)染、逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)檢測(cè)Ｃｓｆｌｒ蛋白水平變化（圖３．５Ａ、Ｂ）。逡逑３４逡逑

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1 牛廷獻(xiàn),羅曉紅,劉庭忠;海人酸致大鼠癲癇模型的建立[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理;1999年01期

2 吳本s

本文編號(hào)：2737866