【摘要】：目的:MicroRNA-155(miR-155)在免疫和炎癥過程中起著重要作用,但目前尚不清楚miR-155介導的炎癥是否參與了癲癇的發(fā)生,本論文通過海人酸(KA)誘導的癲癇動物和細胞模型,來研究miR-155在癲癇疾病過程中的作用,并進一步在癲癇患者的血液中來驗證動物模型的結(jié)果,希望探索新的生物標志物來解決臨床問題。方法:采用KA腹腔注射的C57BL/6小鼠癲癇模型和KA處理的原代細胞癲癇模型,運用腦電圖監(jiān)測、側(cè)腦室立體定位、提取蛋白質(zhì)和RNA、實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、原代細胞培養(yǎng)、Fluoro-Jade B(FJB)染色等大量實驗來研究miR-155的表達水平、分布、靶基因等,并在癲癇患者的血液中,提取miRNA,通過實時熒光定量PCR來驗證miR-155的表達。結(jié)果:在成功的癲癇小鼠模型中,miR-155在癲癇小鼠海馬中的表達較對照組(Ctrl組)顯著升高,腦電圖顯示實驗組(KA組)小鼠出現(xiàn)的癲癇波改變明顯,側(cè)腦室注射miR-155拮抗劑(miR-155 antagomir)后,我們發(fā)現(xiàn)KA+ antagomir組腦電圖的癲癇波出現(xiàn)頻率和幅度較KA組降低,在FJB染色中,KA組較對照組CA2區(qū)神經(jīng)元變性數(shù)量多,KA+ antagomir組神經(jīng)元變性壞死數(shù)目減少;在成功的癲癇細胞模型中,miR-155在膠質(zhì)細胞中的表達比在神經(jīng)元中的高,在小膠質(zhì)細胞中,用50μM的KA處理的時間梯度中,miR-155的表達顯著上調(diào),且通過多個預測靶基因進行實驗性驗證,發(fā)現(xiàn)Csflr隨著時間梯度變化顯著下調(diào),KA+antagomir組Csflr蛋白表達水平較Ctrl組上調(diào);在癲癇患者血液中,與健康對照組相比,miR-155表達水平顯著升高。結(jié)論:MiR-155通過誘導小膠質(zhì)細胞參與炎癥促進癲癇的發(fā)生,靶基因為Csflr;應(yīng)用miR-155 antagomir可減輕癲癇發(fā)作、改善腦電圖放電現(xiàn)象、減少神經(jīng)元受損;血液中miR-155水平可能是癲癇潛在的生物標志物,而抑制小膠質(zhì)細胞中miR-155的表達可能是癲癇的治療策略。
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.1
【圖文】：

笫三章實驗結(jié)果與分析逡逑第三章實驗結(jié)果與分析逡逑３．１邋ｍｉＲ－１５５水平在ＫＡ誘導的癩癇發(fā)作小鼠中升高逡逑將海人酸按１５ｍｇ／ｋｇ的劑量給實驗小鼠腹腔注射，對照組則相同劑量腹腔注逡逑射生理鹽水，癲癇發(fā)作后按Ｒａｃｉｎｅ分級選擇實驗需要的小鼠（癲癇小鼠３只，逡逑對照小鼠３只），２４小時后心臟灌流，取小鼠的海馬和皮層，提�。遥危�，通過實逡逑時定量ＰＣＲ邋（邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋）來檢測處理后的小鼠的大腦中的逡逑ｍｉＲ－１５５／ｍｉＲ－２００ｂ／ｍｉＲ－２３ａ的表達水平。內(nèi)參基因為Ｕ６，實驗中的ｍｉＲＮＡ擴增逡逑曲線平滑，溶解曲線僅有一個溶解峰，結(jié)果顯示，與對照組相比，ＫＡ處理后皮逡逑層和海馬中ｍｉＲ－１５５的水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。逡逑ＡＢ逡逑

腦中不同神經(jīng)細胞類型中的表達情況，我們用５０＾Ｍ濃度的ＫＡ處理細胞后，逡逑用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法來驗證表達，實驗中我們發(fā)現(xiàn)ｍｉＲ－１５５在小膠質(zhì)細胞和星形膠逡逑質(zhì)細胞中的表達比在神經(jīng)元中豐富（圖３．４Ａ）。此外，在富含ｍｉＲ－１５５的小膠逡逑質(zhì)細胞中，觀察隨著時間梯度中ｍｉＲ－１５５的表達情況（圖３．４Ｂ），以此發(fā)現(xiàn)相關(guān)逡逑性來預測靶基因，ｍｉＲ－１５５表達隨著時間推移升高。有文獻顯示［５°］，ｍｉＲ－１５５靶逡逑基因可能為Ｃｓｆｌｒ、Ｔｌｒ６、Ｃ８ｏｒｆ４、Ｐｅａｌ５ａ等，我們用ｑＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)對這些預測逡逑靶基因進行實驗性驗證，觀察ｍＲＮＡ水平的變化，因為ｍｉＲＮＡ對于靶基因的調(diào)逡逑控均是負向調(diào)控，所以隨著時間關(guān)系，靶基因的表達是下調(diào)的，在篩選的多個預逡逑測靶基因中，我們猜測Ｃｓｆｌｒ可能為ｍｉＲ－１５５的靶基因（圖３．４Ｃ）。逡逑己用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法驗證Ｃｓｆｌｒ為ｍｉＲ－１５５的靶基因，接著通過細胞轉(zhuǎn)染、逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)檢測Ｃｓｆｌｒ蛋白水平變化（圖３．５Ａ、Ｂ）。逡逑３４逡逑

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1 牛廷獻,羅曉紅,劉庭忠;海人酸致大鼠癲癇模型的建立[J];實驗動物科學與管理;1999年01期

2 吳本s

本文編號：2737866