【摘要】：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是神經血管單元(neurovascular unit,NVU)中一種獨特的腦血管內皮結構,對于維持中樞系統(tǒng)的正常功能至關重要。BBB中的內皮部分是活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生的主要場所。在永久性和可逆性大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)兩種模型中,ROS的產生呈現(xiàn)不同的上升趨勢。而ROS可以介導腦缺血引起的氧化損傷,損害腦血管內皮屏障的完整性并增高內皮細胞通透性。包括p38和細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk)1/2在內的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的活化參與了短暫性MCAO(transient MCAO,t MCAO)后的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷過程。由MAPK催化的胞漿磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA_2)絲氨酸505位點磷酸化會上調cPLA_2的酶活性,從而釋放花生四烯酸(arachidonic acid,AA),與腦缺血引起的氧化損傷和腦血管的通透性改變密切相關。血管內皮細胞產生的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)對于血管內皮完整性具有強效的調控作用,而1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR)1、S1PR2和S1PR3是在內皮細胞分布的最重要的S1P特異性受體。與激動S1PR1和S1PR3對于血管內皮屏障的完整性具有保護作用相反,阻斷S1PR2會降低血管內皮細胞旁通透性。更為重要的是,在腦I/R模型中,S1PR2的激動能夠引起腦血管內皮細胞中基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9的活化,從而破壞腦血管內皮的完整并增大I/R后腦血管的通透性。促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone,CRH)及其神經肽家族成員能夠對中風在內的多種刺激做出應答,而促腎上腺皮質激素釋放激素受體(corticotrophin-releasing hormone receptor,CRHR)1是對于CRH具有高親和力的G蛋白偶聯(lián)受體。CRHR1拮抗劑可以減輕大鼠永久性局灶性腦缺血引起的腦損傷和腦水腫。CRHR1基因敲除小鼠在局灶性腦缺血后腦組織損傷也明顯減輕,證明CRHR1是介導腦缺血損傷的關鍵分子。大鼠和牛的腦微血管內皮細胞均存在CRH受體的表達,受到CRH刺激后細胞中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的含量會上升,提示CRH可能通過激動受體直接影響腦微血管內皮細胞的結構和功能,從而調控BBB的通透性。因此,CRHR1有可能參與調控腦血管內皮屏障的完整性。本文的研究目的是探討氧化應激條件下S1PR2與CRHR1各自對于腦血管內皮細胞通透性的調控作用和兩者之間的關系,并闡釋分子機制。第一章S1PR2調控氧化應激條件下腦血管內皮細胞的通透性S1PR2和cPLA_2都參與了腦缺血模型中腦血管完整性的破壞。然而,在腦缺血引起的內皮損傷過程中S1PR2對于cPLA_2活性的影響尚不清楚。本章的研究目的是探討S1PR2調控氧化應激誘導的腦血內皮屏障損傷的作用和潛在的分子機制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內皮細胞b End3細胞和小鼠永久性MCAO(permanent MCAO,p MCAO)模型,分別在體外和體內模擬氧化應激對于腦血管內皮細胞的損傷,并使用了阻斷劑和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)干擾技術研究氧化應激對于內皮細胞通透性的作用和分子機制。在b End3細胞中,S1PR2拮抗劑JTE013和cPLA_2抑制劑CAY10502均可明顯抑制過氧化氫誘導的細胞旁通透性和ZO-1定位的改變。過氧化氫通過激活Erk1/2和p38引起cPLA_2的磷酸化,增大內皮細胞的通透性。S1PR2的阻斷和敲減都能顯著抑制過氧化氫誘導的Erk1/2、p38和cPLA_2的磷酸化。在小鼠p MCAO模型中,我們發(fā)現(xiàn)JTE013的預給藥明顯減少了損傷側腦組織伊文思蘭染料(Evans blue dye,EBD)的外滲,并且逆轉了該側血管內皮型鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)、occludin、claudin-5和CD31蛋白表達的下降。此外,JTE013的預給藥還減輕了小鼠的神經功能缺陷、腦水腫和腦梗死體積。我們的實驗結果說明氧化應激條件下S1PR2的激活通過p38和Erk1/2依賴的cPLA_2磷酸化增加了腦血內皮的通透性。第二章CRHR1調控氧化應激條件下腦血管內皮細胞的通透性腦缺血誘導的氧化損傷參與了BBB的破壞。CRHR1的阻斷和基因敲除在嚙齒類動物局灶性腦缺血模型中具有神經保護作用。本章的研究目的是探討CRHR1調控氧化應激引起的腦血管內皮屏障損傷的作用和機制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內皮細胞b End3細胞和小鼠t MCAO模型,分別在體外和體內模擬氧化應激對于腦血管內皮細胞的損傷。我們使用了阻斷劑和RNA干擾技術研究CRHR1調控氧化應激引起的內皮細胞通透性改變的作用和分子機制。在b End3細胞中,我們發(fā)現(xiàn)CRHR1的阻斷和敲減都能明顯地抑制過氧化氫誘導的Erk1/2、p38與cPLA_2的磷酸化和細胞旁高通透性以及ZO-1的重新分布。在小鼠的t MCAO模型中,我們發(fā)現(xiàn)CRHR1拮抗劑NBI27914的預給藥顯著減少了損傷側腦組織EBD的外滲,并且逆轉了該側內皮細胞間連接蛋白表達的下降。NBI27914的預給藥也明顯減輕了小鼠的神經功能缺陷、腦水腫和腦梗死體積。另外,在30分鐘MCAO后再灌注的第七天,CRHR1的敲減減少了損傷側腦組織海馬區(qū)域EBD的外滲。這些實驗結果表明氧化應激條件下CRHR1的激活可能通過p38和Erk1/2依賴的cPLA_2磷酸化增加了腦血內皮的通透性。第三章CRHR1介導氧化應激條件下S1PR2對腦血管內皮細胞通透性的調控作用盡管S1PR2和CRHR1同屬G蛋白偶聯(lián)受體并分布于內皮細胞表面,但是,二者在氧化應激誘導的腦血管內皮屏障損傷過程中的關系一直不明。本章的研究目的是探討CRHR1對于S1PR2調控氧化應激引起的腦血管內皮屏障損傷的作用和潛在機制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內皮細胞b End3細胞和小鼠p MCAO模型分別在體外和體內模擬氧化應激對于腦血管內皮細胞的損傷,并使用了阻斷劑和激動劑研究氧化應激對于內皮細胞通透性的作用和分子機制。我們發(fā)現(xiàn)在b End3細胞中CRHR1激動劑CRH可以逆轉S1PR2拮抗劑JTE013對于過氧化氫誘導的腦血管內皮細胞高通透性和cPLA_2磷酸化的抑制作用;而在小鼠p MCAO的模型中CRH可以逆轉JTE013降低損傷側EBD外滲的作用,并且對抗JTE013對于永久性腦缺血引起的腦水腫、神經細胞損傷和神經功能缺陷的保護作用。這些實驗結果說明CRHR1介導了氧化應激條件下S1PR2的激活增加腦血管內皮細胞通透性的作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743

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本文編號：2731112