【摘要】：血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是神經(jīng)血管單元(neurovascular unit,NVU)中一種獨(dú)特的腦血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu),對(duì)于維持中樞系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要。BBB中的內(nèi)皮部分是活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。在永久性和可逆性大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)兩種模型中,ROS的產(chǎn)生呈現(xiàn)不同的上升趨勢(shì)。而ROS可以介導(dǎo)腦缺血引起的氧化損傷,損害腦血管內(nèi)皮屏障的完整性并增高內(nèi)皮細(xì)胞通透性。包括p38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk)1/2在內(nèi)的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的活化參與了短暫性MCAO(transient MCAO,t MCAO)后的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷過程。由MAPK催化的胞漿磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA_2)絲氨酸505位點(diǎn)磷酸化會(huì)上調(diào)cPLA_2的酶活性,從而釋放花生四烯酸(arachidonic acid,AA),與腦缺血引起的氧化損傷和腦血管的通透性改變密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)對(duì)于血管內(nèi)皮完整性具有強(qiáng)效的調(diào)控作用,而1-磷酸鞘氨醇受體(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR)1、S1PR2和S1PR3是在內(nèi)皮細(xì)胞分布的最重要的S1P特異性受體。與激動(dòng)S1PR1和S1PR3對(duì)于血管內(nèi)皮屏障的完整性具有保護(hù)作用相反,阻斷S1PR2會(huì)降低血管內(nèi)皮細(xì)胞旁通透性。更為重要的是,在腦I/R模型中,S1PR2的激動(dòng)能夠引起腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-9的活化,從而破壞腦血管內(nèi)皮的完整并增大I/R后腦血管的通透性。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotrophin-releasing hormone,CRH)及其神經(jīng)肽家族成員能夠?qū)χ酗L(fēng)在內(nèi)的多種刺激做出應(yīng)答,而促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體(corticotrophin-releasing hormone receptor,CRHR)1是對(duì)于CRH具有高親和力的G蛋白偶聯(lián)受體。CRHR1拮抗劑可以減輕大鼠永久性局灶性腦缺血引起的腦損傷和腦水腫。CRHR1基因敲除小鼠在局灶性腦缺血后腦組織損傷也明顯減輕,證明CRHR1是介導(dǎo)腦缺血損傷的關(guān)鍵分子。大鼠和牛的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞均存在CRH受體的表達(dá),受到CRH刺激后細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的含量會(huì)上升,提示CRH可能通過激動(dòng)受體直接影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,從而調(diào)控BBB的通透性。因此,CRHR1有可能參與調(diào)控腦血管內(nèi)皮屏障的完整性。本文的研究目的是探討氧化應(yīng)激條件下S1PR2與CRHR1各自對(duì)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控作用和兩者之間的關(guān)系,并闡釋分子機(jī)制。第一章S1PR2調(diào)控氧化應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性S1PR2和cPLA_2都參與了腦缺血模型中腦血管完整性的破壞。然而,在腦缺血引起的內(nèi)皮損傷過程中S1PR2對(duì)于cPLA_2活性的影響尚不清楚。本章的研究目的是探討S1PR2調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦血內(nèi)皮屏障損傷的作用和潛在的分子機(jī)制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b End3細(xì)胞和小鼠永久性MCAO(permanent MCAO,p MCAO)模型,分別在體外和體內(nèi)模擬氧化應(yīng)激對(duì)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,并使用了阻斷劑和核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)干擾技術(shù)研究氧化應(yīng)激對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用和分子機(jī)制。在b End3細(xì)胞中,S1PR2拮抗劑JTE013和cPLA_2抑制劑CAY10502均可明顯抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞旁通透性和ZO-1定位的改變。過氧化氫通過激活Erk1/2和p38引起cPLA_2的磷酸化,增大內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。S1PR2的阻斷和敲減都能顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Erk1/2、p38和cPLA_2的磷酸化。在小鼠p MCAO模型中,我們發(fā)現(xiàn)JTE013的預(yù)給藥明顯減少了損傷側(cè)腦組織伊文思蘭染料(Evans blue dye,EBD)的外滲,并且逆轉(zhuǎn)了該側(cè)血管內(nèi)皮型鈣黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)、occludin、claudin-5和CD31蛋白表達(dá)的下降。此外,JTE013的預(yù)給藥還減輕了小鼠的神經(jīng)功能缺陷、腦水腫和腦梗死體積。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明氧化應(yīng)激條件下S1PR2的激活通過p38和Erk1/2依賴的cPLA_2磷酸化增加了腦血內(nèi)皮的通透性。第二章CRHR1調(diào)控氧化應(yīng)激條件下腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性腦缺血誘導(dǎo)的氧化損傷參與了BBB的破壞。CRHR1的阻斷和基因敲除在嚙齒類動(dòng)物局灶性腦缺血模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用。本章的研究目的是探討CRHR1調(diào)控氧化應(yīng)激引起的腦血管內(nèi)皮屏障損傷的作用和機(jī)制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b End3細(xì)胞和小鼠t MCAO模型,分別在體外和體內(nèi)模擬氧化應(yīng)激對(duì)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。我們使用了阻斷劑和RNA干擾技術(shù)研究CRHR1調(diào)控氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的作用和分子機(jī)制。在b End3細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)CRHR1的阻斷和敲減都能明顯地抑制過氧化氫誘導(dǎo)的Erk1/2、p38與cPLA_2的磷酸化和細(xì)胞旁高通透性以及ZO-1的重新分布。在小鼠的t MCAO模型中,我們發(fā)現(xiàn)CRHR1拮抗劑NBI27914的預(yù)給藥顯著減少了損傷側(cè)腦組織EBD的外滲,并且逆轉(zhuǎn)了該側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)的下降。NBI27914的預(yù)給藥也明顯減輕了小鼠的神經(jīng)功能缺陷、腦水腫和腦梗死體積。另外,在30分鐘MCAO后再灌注的第七天,CRHR1的敲減減少了損傷側(cè)腦組織海馬區(qū)域EBD的外滲。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氧化應(yīng)激條件下CRHR1的激活可能通過p38和Erk1/2依賴的cPLA_2磷酸化增加了腦血內(nèi)皮的通透性。第三章CRHR1介導(dǎo)氧化應(yīng)激條件下S1PR2對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控作用盡管S1PR2和CRHR1同屬G蛋白偶聯(lián)受體并分布于內(nèi)皮細(xì)胞表面,但是,二者在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮屏障損傷過程中的關(guān)系一直不明。本章的研究目的是探討CRHR1對(duì)于S1PR2調(diào)控氧化應(yīng)激引起的腦血管內(nèi)皮屏障損傷的作用和潛在機(jī)制。我們采用過氧化氫刺激的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞b End3細(xì)胞和小鼠p MCAO模型分別在體外和體內(nèi)模擬氧化應(yīng)激對(duì)于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,并使用了阻斷劑和激動(dòng)劑研究氧化應(yīng)激對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用和分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在b End3細(xì)胞中CRHR1激動(dòng)劑CRH可以逆轉(zhuǎn)S1PR2拮抗劑JTE013對(duì)于過氧化氫誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞高通透性和cPLA_2磷酸化的抑制作用;而在小鼠p MCAO的模型中CRH可以逆轉(zhuǎn)JTE013降低損傷側(cè)EBD外滲的作用,并且對(duì)抗JTE013對(duì)于永久性腦缺血引起的腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)功能缺陷的保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明CRHR1介導(dǎo)了氧化應(yīng)激條件下S1PR2的激活增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2731112