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mTOR通過CD44活化Src促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長錐形成及突起的生長

發(fā)布時間:2020-06-26 20:03
【摘要】:中樞神經(jīng)損傷后,如何提高神經(jīng)元再生能力,促進(jìn)軸突再生,恢復(fù)神經(jīng)功能是世界一大醫(yī)學(xué)難題。文獻(xiàn)表明PI3K/PTEN/Akt/m TOR信號通路是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生的重要調(diào)節(jié)因子,對軸突的發(fā)生和延伸都有重要作用,但其作用機(jī)制不清。我們致力于尋找其下游與軸突再生相關(guān)的靶點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn),CD44是m TOR調(diào)節(jié)軸突再生與生長錐形成的下游關(guān)鍵分子,查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)CD44與Src具有相關(guān)性,CD44沉默可以降低Src活性,且CD44沉默導(dǎo)致的樹突形態(tài)的改變可因Src激活而恢復(fù);谝陨媳尘,我們推測m TOR可能通過CD44調(diào)節(jié)Src活性進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長錐形成及突起的生長。本研究選用SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元作為體外神經(jīng)元模型。設(shè)計(jì)PTENsh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA沉默質(zhì)粒,干擾神經(jīng)元PTEN及CD44的表達(dá)。應(yīng)用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)闡明m TOR是否通過CD44活化Src促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長錐形成及突起的生長。方法:原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元,首先采用PTEN sh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測PTEN、CD44和Src m RNA表達(dá)的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測PTEN,m TOR,CD44,Src蛋白水平的變化;其次在PTENi沉默后加入Src活性有效抑制劑(PP2),觀察p Src蛋白水平的變化,明確體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞中m TOR是否通過CD44調(diào)節(jié)Src活性。應(yīng)用MTT法確定過氧化氫濃度,建立神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型。p Src免疫熒光染色觀察PTENi組、PTENi+PP2組、PTENi+CD44i組損傷神經(jīng)元p Src的表達(dá)。利用Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)特異性染色標(biāo)記肌動蛋白(F-actin),觀察PTENi、PTENi+PP2、PTENi+CD44i干擾后損傷神經(jīng)元生長錐及突起變化,以證明m TOR是否通過CD44活化Src,進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長錐形成及突起的生長。結(jié)果:神經(jīng)元生長3d時,轉(zhuǎn)染PTENsh RNA,CD44sh RNA,PTEN+CD44sh RNA基因干擾質(zhì)粒,篩選有效的干擾序列;運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)顯示,PTENi沉默時,CD44,Src表達(dá)水平升高(P0.001);CD44i沉默時,CD44,Src表達(dá)水平均降低(P0.001);PTENi+CD44i雙干擾時,m TOR表達(dá)水平升高,而PTEN,CD44,Src表達(dá)水平均降低(P0.001);PTENi組激活p Src,PTENi+PP2組和PTENi+CD44i組p Src活性與PTENi組相比顯著降低(P0.001)。MTT法顯示,200μM過氧化氫時,細(xì)胞存活率為60%,可以用于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。p Src免疫熒光染色顯示,損傷神經(jīng)元PTENi組,p Src在細(xì)胞內(nèi)和生長錐末端表達(dá)較高,而sh NC組,PTENi+PP2組,PTENi+CD44i組p Src在細(xì)胞內(nèi)(P0.01)和生長錐末端表達(dá)較少(P0.05)。F-actin標(biāo)記的生長錐和突起統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,損傷神經(jīng)元PTENi組生長錐數(shù)目,面積和初級突起數(shù)明顯高于sh NC組,PTENi+PP2組,PTENi+CD44i組(P0.05)。同時,Sholl分析顯示,PTENi沉默,顯著提高損傷神經(jīng)元突起復(fù)雜程度(P0.001);損傷神經(jīng)元PTENi組突起總長度和軸突長度明顯高于sh NC組、PTENi+PP2組、PTENi+CD44i組(P0.01)。結(jié)論:mTOR通過CD44活化Src,進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長錐形成及突起的生長。
【學(xué)位授予單位】:吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號】:R741
【圖文】:

示意圖,信號通路,示意圖,神經(jīng)系統(tǒng)損傷


圖 1.1 PI3K/PTEN/Akt/mTOR 信號通路示意圖2.3.1 抑制 PTEN,激活 mTOR 促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突再生一項(xiàng)近年來神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生研究的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,越來越多的科研工作者將目光放在 PI3K/ PTEN/Akt/mTOR 信號通路提高神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生能力機(jī)制上 。mTOR 是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,增殖和生存的調(diào)節(jié)器[38,39]。 mTOR的合成代謝機(jī)制和分解代謝機(jī)制在軸突再生中起重要作用。在發(fā)育的大腦中,

極化過程,軸突,微絲,微管


圖 1.2 神經(jīng)元極化過程 微管(綠)和微絲(紅)在軸突延伸過程中的分布神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突成功再生的判斷條件是斷端重構(gòu)出新的生長錐。生長錐的再生是肌動蛋白動力學(xué),包括生長錐肌動蛋白絲(F-actin)功能動力學(xué),調(diào)節(jié)肌動蛋白結(jié)合蛋白(ABPs)和信號傳導(dǎo)過程[64]。生長錐擴(kuò)張是軸突向外延伸的必要條件,而軸突損傷后生長錐形成需要細(xì)胞各個方面綜合調(diào)控。一個新的生長錐形成是生長錐形成相關(guān)蛋白在細(xì)胞局部的翻譯。研究表明生長錐的再生可能與肌動蛋白相關(guān)蛋白,高爾基體相關(guān)蛋白,死亡相關(guān)蛋白激酶樣激酶,c-Jun 氨基末端激酶,絲裂原活化蛋白激酶,Ran 結(jié)合蛋白,細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號抑制分子(SOCS3)、膜興奮性、突觸傳遞,神經(jīng)突觸內(nèi)吞作用等等相關(guān)[65]。在軸突延伸期間,生長錐絲狀偽足指明延伸方向。體外研究表明,絲狀偽足的不對稱延伸是軸突生長的基礎(chǔ)[66]。生長錐尖端復(fù)合物的組成部分已經(jīng)被鑒定,包括肌動蛋白結(jié)合蛋白,運(yùn)動蛋白肌球蛋白 III,a1 整聯(lián)蛋白[67]。前期實(shí)驗(yàn)表明,mTOR 通過 CD44 調(diào)節(jié)類神經(jīng)元再生。查閱文獻(xiàn)得知,CD4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Prognostic significance of PTEN,Ki-67 and CD44s expression patterns in gastrointestinal stromal tumors[J];World Journal of Gastroenterology;2012年14期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 彭茹;mTOR信號通路通過CD44促進(jìn)損傷類神經(jīng)元突起生長的研究[D];吉林大學(xué);2016年



本文編號:2730823

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