【摘要】：中樞神經(jīng)損傷后,如何提高神經(jīng)元再生能力,促進(jìn)軸突再生,恢復(fù)神經(jīng)功能是世界一大醫(yī)學(xué)難題。文獻(xiàn)表明PI3K/PTEN/Akt/m TOR信號(hào)通路是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生的重要調(diào)節(jié)因子,對(duì)軸突的發(fā)生和延伸都有重要作用,但其作用機(jī)制不清。我們致力于尋找其下游與軸突再生相關(guān)的靶點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn),CD44是m TOR調(diào)節(jié)軸突再生與生長(zhǎng)錐形成的下游關(guān)鍵分子,查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)CD44與Src具有相關(guān)性,CD44沉默可以降低Src活性,且CD44沉默導(dǎo)致的樹(shù)突形態(tài)的改變可因Src激活而恢復(fù)�；谝陨媳尘�,我們推測(cè)m TOR可能通過(guò)CD44調(diào)節(jié)Src活性進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長(zhǎng)錐形成及突起的生長(zhǎng)。本研究選用SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元作為體外神經(jīng)元模型。設(shè)計(jì)PTENsh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA沉默質(zhì)粒,干擾神經(jīng)元PTEN及CD44的表達(dá)。應(yīng)用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)闡明m TOR是否通過(guò)CD44活化Src促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長(zhǎng)錐形成及突起的生長(zhǎng)。方法:原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮層神經(jīng)元,首先采用PTEN sh RNA,CD44 sh RNA,PTEN+CD44 sh RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PTEN、CD44和Src m RNA表達(dá)的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)PTEN,m TOR,CD44,Src蛋白水平的變化;其次在PTENi沉默后加入Src活性有效抑制劑(PP2),觀察p Src蛋白水平的變化,明確體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元細(xì)胞中m TOR是否通過(guò)CD44調(diào)節(jié)Src活性。應(yīng)用MTT法確定過(guò)氧化氫濃度,建立神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型。p Src免疫熒光染色觀察PTENi組、PTENi+PP2組、PTENi+CD44i組損傷神經(jīng)元p Src的表達(dá)。利用Phalloidin(鬼筆環(huán)肽)特異性染色標(biāo)記肌動(dòng)蛋白(F-actin),觀察PTENi、PTENi+PP2、PTENi+CD44i干擾后損傷神經(jīng)元生長(zhǎng)錐及突起變化,以證明m TOR是否通過(guò)CD44活化Src,進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長(zhǎng)錐形成及突起的生長(zhǎng)。結(jié)果:神經(jīng)元生長(zhǎng)3d時(shí),轉(zhuǎn)染PTENsh RNA,CD44sh RNA,PTEN+CD44sh RNA基因干擾質(zhì)粒,篩選有效的干擾序列;運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)顯示,PTENi沉默時(shí),CD44,Src表達(dá)水平升高(P0.001);CD44i沉默時(shí),CD44,Src表達(dá)水平均降低(P0.001);PTENi+CD44i雙干擾時(shí),m TOR表達(dá)水平升高,而PTEN,CD44,Src表達(dá)水平均降低(P0.001);PTENi組激活p Src,PTENi+PP2組和PTENi+CD44i組p Src活性與PTENi組相比顯著降低(P0.001)。MTT法顯示,200μM過(guò)氧化氫時(shí),細(xì)胞存活率為60%,可以用于構(gòu)建氧化應(yīng)激模型。p Src免疫熒光染色顯示,損傷神經(jīng)元PTENi組,p Src在細(xì)胞內(nèi)和生長(zhǎng)錐末端表達(dá)較高,而sh NC組,PTENi+PP2組,PTENi+CD44i組p Src在細(xì)胞內(nèi)(P0.01)和生長(zhǎng)錐末端表達(dá)較少(P0.05)。F-actin標(biāo)記的生長(zhǎng)錐和突起統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,損傷神經(jīng)元PTENi組生長(zhǎng)錐數(shù)目,面積和初級(jí)突起數(shù)明顯高于sh NC組,PTENi+PP2組,PTENi+CD44i組(P0.05)。同時(shí),Sholl分析顯示,PTENi沉默,顯著提高損傷神經(jīng)元突起復(fù)雜程度(P0.001);損傷神經(jīng)元PTENi組突起總長(zhǎng)度和軸突長(zhǎng)度明顯高于sh NC組、PTENi+PP2組、PTENi+CD44i組(P0.01)。結(jié)論:mTOR通過(guò)CD44活化Src,進(jìn)而促進(jìn)損傷神經(jīng)元生長(zhǎng)錐形成及突起的生長(zhǎng)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741
【圖文】：

圖 1.1 PI3K/PTEN/Akt/mTOR 信號(hào)通路示意圖2.3.1 抑制 PTEN,激活 mTOR 促進(jìn)損傷神經(jīng)元軸突再生一項(xiàng)近年來(lái)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生研究的相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，越來(lái)越多的科研工作者將目光放在 PI3K/ PTEN/Akt/mTOR 信號(hào)通路提高神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生能力機(jī)制上 。mTOR 是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，增殖和生存的調(diào)節(jié)器[38,39]。 mTOR的合成代謝機(jī)制和分解代謝機(jī)制在軸突再生中起重要作用。在發(fā)育的大腦中，

圖 1.2 神經(jīng)元極化過(guò)程 微管（綠）和微絲（紅）在軸突延伸過(guò)程中的分布神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突成功再生的判斷條件是斷端重構(gòu)出新的生長(zhǎng)錐。生長(zhǎng)錐的再生是肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)，包括生長(zhǎng)錐肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）功能動(dòng)力學(xué)，調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABPs）和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[64]。生長(zhǎng)錐擴(kuò)張是軸突向外延伸的必要條件，而軸突損傷后生長(zhǎng)錐形成需要細(xì)胞各個(gè)方面綜合調(diào)控。一個(gè)新的生長(zhǎng)錐形成是生長(zhǎng)錐形成相關(guān)蛋白在細(xì)胞局部的翻譯。研究表明生長(zhǎng)錐的再生可能與肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，高爾基體相關(guān)蛋白，死亡相關(guān)蛋白激酶樣激酶，c-Jun 氨基末端激酶，絲裂原活化蛋白激酶，Ran 結(jié)合蛋白，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)抑制分子（SOCS3）、膜興奮性、突觸傳遞，神經(jīng)突觸內(nèi)吞作用等等相關(guān)[65]。在軸突延伸期間，生長(zhǎng)錐絲狀偽足指明延伸方向。體外研究表明，絲狀偽足的不對(duì)稱延伸是軸突生長(zhǎng)的基礎(chǔ)[66]。生長(zhǎng)錐尖端復(fù)合物的組成部分已經(jīng)被鑒定，包括肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，運(yùn)動(dòng)蛋白肌球蛋白 III，a1 整聯(lián)蛋白[67]。前期實(shí)驗(yàn)表明，mTOR 通過(guò) CD44 調(diào)節(jié)類神經(jīng)元再生。查閱文獻(xiàn)得知，CD4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Prognostic significance of PTEN,Ki-67 and CD44s expression patterns in gastrointestinal stromal tumors[J];World Journal of Gastroenterology;2012年14期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 彭茹;mTOR信號(hào)通路通過(guò)CD44促進(jìn)損傷類神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的研究[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2730823