【摘要】：背景遺傳性共濟(jì)失調(diào)是一類常見的神經(jīng)遺傳退行性疾病,以小腦性共濟(jì)失調(diào)、小腦萎縮等為主要臨床特征,雖經(jīng)多年研究,但至今致病機(jī)制仍未研究清楚,同時治療手段極為有限。臨床病理及動物實驗中發(fā)現(xiàn),小腦中浦肯野細(xì)胞等的數(shù)量減少是遺傳性共濟(jì)失調(diào)的重要病理特征。為此研究遺傳性共濟(jì)失調(diào)的致病機(jī)制對于該類疾病的臨床治療具有重要意義。Gordon Holmes綜合征是一種特殊類型的遺傳性共濟(jì)失調(diào)類疾病,臨床表現(xiàn)為青少年起病的進(jìn)行性小腦性共濟(jì)失調(diào)同時合并有性腺發(fā)育不全,其遺傳方式為常染色體隱性遺傳。盡管臨床上對于此疾病的認(rèn)識已有100余年歷史,但直到2013年5月,其第一種和第二種致病基因RNF216和OTUD4才被鑒定克隆。我們在2014年收集到了中國大陸首個Gordon Holmes綜合征家系,同時應(yīng)用全外顯子測序發(fā)現(xiàn)了該病的第三種致病基因STUB1,其致病突變位點(diǎn)是T246M。STUB1具有泛素E3連接酶活性,同時可與Hsp70、Hsp90等分子伴侶相互作用,在蛋白質(zhì)質(zhì)量控制中起關(guān)鍵作用,STUB1功能障礙可導(dǎo)致體內(nèi)蛋白的錯誤折疊和聚集。近年來研究表明,STUB1也可通過調(diào)節(jié)其他途徑如壞死性凋亡等參與神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)制。在其他種族人群中也有STUB1基因突變導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)的報道,且TPR結(jié)構(gòu)域和U-box結(jié)構(gòu)域的突變均可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。新的報道中臨床表現(xiàn)更為復(fù)雜,錐體束損傷更為明顯。這一現(xiàn)象提示我們STUB1基因突變不僅可以導(dǎo)致小腦神經(jīng)元功能障礙,還可以影響運(yùn)動神經(jīng)元的功能,但具體機(jī)制仍不清楚。為了深入研究STUB1導(dǎo)致Gordon Holmes綜合征的致病機(jī)制并提供合適的動物模型,我們應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了STUB1基因T246M突變的轉(zhuǎn)基因大鼠。該疾病模型表現(xiàn)體重減輕,壽命縮短,運(yùn)動協(xié)調(diào)性下降,平衡能力受損,同時病理上表現(xiàn)為浦肯野細(xì)胞死亡。隨后,我們應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了STUB1突變大鼠小腦組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)以進(jìn)一步探討其致病機(jī)制。共鑒定出143種差異表達(dá)蛋白,其中表達(dá)上調(diào)蛋白80種,表達(dá)下調(diào)蛋白63種。這些差異表達(dá)蛋白生物功能主要涉及分子結(jié)合、催化反應(yīng)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體功能、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性調(diào)節(jié)、受體活性、電荷轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等方面;蛋白位置分布涉及細(xì)胞漿、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞外區(qū)域等方面;生物過程主要有細(xì)胞過程、單細(xì)胞有機(jī)體過程、代謝過程、刺激反應(yīng)過程、生物調(diào)節(jié)過程、多細(xì)胞有機(jī)體過程、信號傳導(dǎo)過程、發(fā)育過程方面。KEGG Pathway分析表明差異表達(dá)蛋白主要集中于免疫、內(nèi)分泌、代謝等方面。同時結(jié)合當(dāng)前研究,我們認(rèn)為差異表達(dá)蛋白中PDE9A、tau、PHLPP1、α-syn等可能參與致病。這種新型的大鼠模型忠實地模擬了人類Gordon Holmes綜合征疾病的臨床表型,并將用于深入研究STUB1相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的致病機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果為進(jìn)一步的機(jī)制及潛在治療策略研究提供了思路和依據(jù)。目的1.構(gòu)建STUB1基因點(diǎn)突變Gordon Holmes綜合征大鼠疾病模型。2.通過檢測大鼠疾病模型的行為學(xué)、STUB1蛋白表達(dá)量的變化以及疾病模型小腦等組織的病理學(xué)特征和生殖能力,分析STUB1基因點(diǎn)突變Gordon Holmes綜合征大鼠疾病模型能否較好的模擬該病的臨床表型。3.應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究Gordon Holmes綜合征可能的致病機(jī)制,為深入研究及探索治療策略提供依據(jù)。方法1.應(yīng)用Cas9/sgRNA技術(shù)及顯微注射技術(shù)構(gòu)建STUB1基因定點(diǎn)突變大鼠,并進(jìn)行基因型鑒定。2.應(yīng)用轉(zhuǎn)輪實驗、Catwalk步態(tài)分析、水迷宮等分析大鼠行為學(xué);應(yīng)用western blot、免疫化學(xué)染色等分析大鼠STUB1基因表達(dá)及浦肯野細(xì)胞數(shù)量;應(yīng)用放射免疫分析大鼠性激素水平。3.應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及生物信息分析技術(shù)對純合型大鼠蛋白表達(dá)進(jìn)行分析,并選擇可能與致病機(jī)制相關(guān)的通路或蛋白。結(jié)果1.STUB1基因點(diǎn)突變Gordon Holmes綜合征大鼠疾病模型構(gòu)建成功。經(jīng)過鼠尾提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測序,獲得了具有穩(wěn)定基因型的子代大鼠。2.在行為學(xué)實驗中,從第12周開始,純合型大鼠轉(zhuǎn)輪實驗掉落潛伏期明顯縮短(P0.05);從第16周開始步態(tài)分析也表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。從發(fā)病早期開始,純合型大鼠即表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶功能的減低(P0.05)。此外,從第8周起,純合型大鼠體重減低(P0.05);生存時間縮短(P0.05)。以上各指標(biāo)中,雜合型與野生型相比無明顯差異。3.經(jīng)western blot檢測,純合型大鼠大腦、小腦、睪丸中STUB1蛋白表達(dá)水平減低(P0.05),且高周齡減低更為明顯,免疫組化結(jié)果與之一致。經(jīng)免疫熒光檢測,純合型大鼠小腦中浦肯野細(xì)胞數(shù)量減少(P0.05)。同時,純合型大鼠的海馬組織可見細(xì)胞形態(tài)明顯異常及排列紊亂。4.大鼠血清水平測定結(jié)果顯示:純合型STUB1點(diǎn)突變大鼠雌二醇水平減低(P0.05),卵泡刺激素、黃體生成素含量增高(P0.05),野生型與雜合型無明顯區(qū)別。5.經(jīng)與野生型比較分析,共得出純合型大鼠疾病模型差異表達(dá)蛋白143個,其中上調(diào)蛋白80個,下調(diào)蛋白63個,蛋白表達(dá)存在差異。6.通過對STUB1點(diǎn)突變動物模型差異表達(dá)蛋白GO注釋和KEGG pathway分析,其生物功能主要涉及分子結(jié)合、催化反應(yīng)活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體功能、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性調(diào)節(jié)、受體活性、電荷轉(zhuǎn)運(yùn)體活性等12個方面,差異表達(dá)蛋白位置分布涉及細(xì)胞漿、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、大分子復(fù)合物、細(xì)胞外區(qū)域等16個方面,差異表達(dá)蛋白參與的生物過程有細(xì)胞過程、單細(xì)胞有機(jī)體過程、代謝過程、刺激反應(yīng)過程、生物調(diào)節(jié)過程、多細(xì)胞有機(jī)體過程、信號傳導(dǎo)過程、發(fā)育過程等23個方面。KEGG pathway則表明差異蛋白主要集中于免疫、內(nèi)分泌、代謝等方面。7.在上述分析結(jié)果的基礎(chǔ)上結(jié)合查閱文獻(xiàn)篩選得到了一些可能與Gordon Holmes綜合征致病機(jī)制有關(guān)的蛋白如PDE9A、tau、PHLPP1、α-syn等,并對其進(jìn)行了初步驗證。結(jié)論1.通過應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),STUB1基因點(diǎn)突變大鼠Gordon Holmes綜合征疾病模型構(gòu)建成功。2.與野生型與雜合型相比,純合型STUB1點(diǎn)突變大鼠疾病模型行為學(xué)檢測指標(biāo)顯示其平衡及運(yùn)動協(xié)調(diào)能力均明顯減低,學(xué)習(xí)記憶功能也明顯減低。STUB1基因的表達(dá)在純合型大鼠明顯減低,且進(jìn)行性減少;組織病理學(xué)特征顯示小腦浦肯野細(xì)胞明顯減少;且表現(xiàn)出生殖能力低下的表型,表明Gordon Holmes綜合征大鼠疾病模型很好地模擬了人類疾病臨床表型,為深入研究致病機(jī)制及治療策略打下了基礎(chǔ)。3.通過蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息分析可知STUB1點(diǎn)突變大鼠與野生型大鼠的蛋白表達(dá)存在很大差異,并得出了一系列可能的致病通路及蛋白,以上分析結(jié)果為進(jìn)一步研究Gordon Holmes綜合征和其他CHIP相關(guān)疾病的致病機(jī)制以及探索治療策略提供了新思路新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R744.7
【圖文】：

圖 1.1 打靶載體示意圖STUB1 基因敲入的打靶載體主要包括以下功能元件： 點(diǎn)突變位點(diǎn)：exon6（p.T247M）； 5’端和 3’端的同源臂均約為 2kb；1.1.4.2 靶序列的測序確認(rèn)1.1.4.2.1 SD 大鼠鼠尾 DNA 提取1）剪取擬進(jìn)行實驗的大鼠尾尖部 0.3-0.5cm；2）配制 1×裂解液，裂解配制方法為單個樣品中 4μl Proteinase K，200μl 1×Mouse tissue Lysis Buffer，將二者渦旋震蕩，充分混勻后方可使用；3）將鼠尾放于 1.5ml EP 管中，添加 200μl 1×裂解液浸沒鼠尾樣本，渦旋震蕩后 55℃水浴中孵育 30min；4）待孵育完成后，將樣品置于 100℃干浴鍋中加熱 5min 滅活 Proteinase K；

圖 1.2 基因型鑒定引物設(shè)計策略2）大鼠標(biāo)記仔鼠出生 7 天左右，剪去不同腳趾的末節(jié)，通過不同腳趾的缺失排布以確定該鼠的編號。此法不需麻醉，只截去趾的末節(jié)以防指甲重長。符號說明：前肢用字母 F（front leg）表示，后肢用字母 R（rear leg）表示；3）鼠尾 DNA 提取及 PCR 擴(kuò)增鼠尾 DNA 提取步驟見 1.1.4.2.1，PCR 反應(yīng)體系同表 1-14）PCR 反應(yīng)條件見表 1.11表 1.11 子代大鼠基因型鑒定 PCR 反應(yīng)條件溫度 時間94℃ 5min94℃ 30s67℃ 30s (-0.7℃/s) 15cycles68℃ 1kb/min94℃ 30s

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳偉強(qiáng);程義勇;李樹田;洪燕;王冬蘭;侯s

本文編號：2729395