【摘要】：目的:通過腹腔注射(Intraperitoneal,i.p)匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status Epilepticus,SE)形成,探討慢性癲癇發(fā)作后腹外側(cè)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(the Ventrolateral Periaqueductal Gray,vl PAG)-腳橋核(Pedunculopontine Nucleus,PPN)通路神經(jīng)傳導(dǎo)的變化。方法:選取4~5周齡、體重80-110g的健康雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠,隨機(jī)分成A、B兩組,再分別將A、B兩組均隨機(jī)分為對照組(Control)、匹羅卡品(Pilocarpine,Pilo)組、SE+Pilo組三組,每組6只大鼠。對A、B兩組的SE+Pilo組予以腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE),Control組和Pilo組分別注射相同劑量的生理鹽水。28天后運(yùn)用腦立體定位儀向三組大鼠腦的腳橋核PPN區(qū)注射神經(jīng)纖維逆向示蹤劑熒光金(Fluoro Gold,FG),2天后分別對Pilo組和SE+Pilo組再次腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài),Control組腹腔注射相同劑量的生理鹽水,分別觀察各組大鼠的癲癇發(fā)作狀態(tài)和活動情況。1小時(shí)后,A組大鼠立即灌注固定取腦,然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對各組vl PAG區(qū)內(nèi)c-Fos和囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Vesicular Glutamate Transporter 1,v GLUT1)進(jìn)行計(jì)數(shù),對逆向示蹤劑熒光金FG標(biāo)記的c-Fos或v GLUT1進(jìn)行計(jì)數(shù)以及FG的平均免疫熒光強(qiáng)度,分析vl PAG區(qū)內(nèi)c-Fos和v GLUT1以及逆向示蹤劑熒光金FG標(biāo)記的c-Fos或v GLUT1的表達(dá)水平;B組大鼠應(yīng)用熱刺痛儀測試三組大鼠的熱刺激撤足潛伏期(Paw Withdrawl Latency,PWL),觀察三組大鼠的疼痛閾值是否升高或者降低。將熒光金FG注射到PPN中,通過在vl PAG中檢測到熒光金FG,追蹤從vl PAG到PPN通路的神經(jīng)傳導(dǎo)。采用FG免疫熒光強(qiáng)度和逆向示蹤劑熒光金FG神經(jīng)元數(shù)目評價(jià)vl PAG-PPN通路的神經(jīng)傳導(dǎo)活性。采用免疫組化方法計(jì)數(shù)各組c-Fos和v GLUT1以及FG標(biāo)記的c-Fos或v GLUT1,分析癲癇發(fā)作和慢性癲癇發(fā)作后vl PAG-PPN通路興奮性傳導(dǎo)的變化。本研究中所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(M±SEM)形式表示,運(yùn)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析三組免疫熒光染色數(shù)據(jù)和痛覺測試數(shù)據(jù),運(yùn)用LSD-t檢驗(yàn)(Least-significant differencetest)分析每兩組之間的差異,認(rèn)為P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:A組:在Pilo組和SE+Pilo組兩組大鼠的vl PAG神經(jīng)元區(qū)域均能發(fā)現(xiàn)大量的熒光金FG,FG平均免疫熒光強(qiáng)度較Control組明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在vl PAG神經(jīng)元中,與Pilo組相比,SE+Pilo組FG平均熒光強(qiáng)度明顯降低,c-Fos和vGLUT1的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少,FG標(biāo)記的c-Fos或v GLUT1計(jì)數(shù)也明顯減少,但是顯著高于Control組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。B組:SE+Pilo組熱刺激撤足潛伏期時(shí)間較Pilo組明顯縮短,但比Control組大鼠明顯延長,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:癲癇發(fā)作激活vl PAG-PPN通路的興奮性傳導(dǎo),降低了疼痛敏感性,痛覺閾值升高;慢性癲癇發(fā)作后vl PAG-PPN通路的興奮性傳導(dǎo)弱化,增強(qiáng)了疼痛敏感性,痛覺閾值降低。因此,vl PAG-PPN通路興奮性傳導(dǎo)減弱與慢性癲癇有關(guān),提示這種興奮性傳導(dǎo)參與了癲癇和偏頭痛的共患病關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1
【圖文】：

圖 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Fig 1 The experiment design2.2.2 腹腔注射匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)對 A、B 兩組大鼠分別進(jìn)行標(biāo)記并稱重記錄后，先對 Pilo組（30 天后）和SE+Pilo 組（30 天前和 30 天后）大鼠予以生理鹽水新鮮配置的東莨菪堿溶液（1ml/kg）腹腔注射預(yù)處理，以拮抗匹羅卡品引起的外周膽堿能副作用，30min后，再對大鼠腹腔注射新鮮制備的匹羅卡品溶液（350mg/kg）誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status Epilepticus, SE），觀察大鼠的癲癇行為表現(xiàn) ,判斷 SE+Pilo 組大鼠是否形成癲癇持續(xù)狀態(tài)。30 min 后，如果某些大鼠沒有表現(xiàn)出癇性發(fā)作或發(fā)作狀

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文譜指定的 PPN區(qū)域，以 0.1ul/min的速度緩慢注射 FG，每注射完 0.1ul后，微量注射器需靜置 2min以使 FG 充分吸收，待注射完 0.5ul FG 后留針靜置 10min再緩慢拔針，以防拔針過程中熒光金隨針道溢出。使用相同的方法完成另一側(cè)定位點(diǎn)的腦內(nèi)注射。2.2.3.7 拔針后充分止血，用碘伏消毒手術(shù)區(qū)，用縫線間斷縫合手術(shù)切口并再次用碘伏消毒，然后腹腔注射青霉素（1.2ml/kg），防止手術(shù)切口發(fā)生感染，待其麻醉蘇醒后放入籠中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng) 48h。

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本文編號：2728591