【摘要】：多發(fā)性硬化是一種常見(jiàn)的導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的自身免疫性疾病,它以中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥、白質(zhì)脫髓鞘、軸突和神經(jīng)元丟失為主要病理改變。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是MS的非常經(jīng)典的動(dòng)物模型,多年來(lái)廣泛應(yīng)用于MS的基礎(chǔ)性研究。目前MS治療包括干擾素β、糖皮質(zhì)激素等,但這些藥物只對(duì)部分患者有效且療效不顯著,免疫抑制劑等藥物雖有顯著療效,但因副作用大嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用,因此MS治療一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞,在多發(fā)性硬化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。巨噬細(xì)胞可分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞,M1型是促炎型巨噬細(xì)胞,釋放促炎因子,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)組織損傷,M2型是抗炎型巨噬細(xì)胞,具有抗炎并促進(jìn)組織修復(fù)的作用。研究發(fā)現(xiàn)MS患者在疾病急性期大腦及脊髓內(nèi)浸潤(rùn)的致炎細(xì)胞主要為促炎型M1細(xì)胞,不是抗炎型M2細(xì)胞,因此推論造成MS腦內(nèi)炎癥病變的主要致炎細(xì)胞是M1巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用MRI監(jiān)測(cè)小鼠腦內(nèi)標(biāo)記的M1/M2細(xì)胞示蹤劑后發(fā)現(xiàn),在嚴(yán)重復(fù)發(fā)型EAE小鼠腦內(nèi)M1增多,EAE的復(fù)發(fā)明顯,而小鼠腦中M2細(xì)胞增多則有利于EAE的緩解同時(shí)能夠加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)。因此抑制M1,促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)化可能有助于MS的治療。研究目的:研究巨噬細(xì)胞亞型在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病的作用及其機(jī)制研究。建立EAE模型,觀(guān)察(1)M1和M2細(xì)胞在EAE中的作用;(2)誘導(dǎo)M2細(xì)胞分化,過(guò)繼轉(zhuǎn)移M2,觀(guān)察M2對(duì)EAE小鼠的治療作用;(3)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κb對(duì)M1向M2轉(zhuǎn)化的作用。研究方法:(1)用MOG35-55加完全弗氏佐劑(FCA)混合乳液,皮下注射C57BL/6小鼠,同時(shí)腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)建立EAE模型;(2)觀(guān)察M1、M2細(xì)胞在EAE中的作用:在發(fā)病不同時(shí)期取EAE小鼠(1)脊髓通過(guò)病理染色(HE和髓鞘染色),觀(guān)察EAE小鼠脊髓炎癥及髓鞘脫失的情況;(2)分離EAE小鼠脾臟,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)選取巨噬細(xì)胞(F4/80,CD11b)進(jìn)行M1、M2表型測(cè)定(M1檢測(cè)i NOS,CD40,M2檢測(cè)Arg-1,CD206以鑒別M1和M2);(3)通過(guò)CBA方法檢測(cè)EAE不同發(fā)病時(shí)期M1/M2細(xì)胞分泌炎性/抗炎性細(xì)胞因子;(3)誘導(dǎo)M2細(xì)胞分化,過(guò)繼轉(zhuǎn)移M2,觀(guān)察M2對(duì)EAE小鼠的治療作用:(1)取同品系小鼠骨髓干細(xì)胞,體外通過(guò)加入IL-4/M-CSF刺激骨髓干細(xì)胞朝M2方向轉(zhuǎn)化;(2)經(jīng)流式細(xì)胞儀確認(rèn)M2細(xì)胞占有90%以上;(3)于EAE小鼠剛發(fā)病時(shí)回輸M2細(xì)胞同時(shí)設(shè)立對(duì)照組,觀(guān)察臨床癥狀;(4)巨噬細(xì)胞對(duì)EAE治療起效1-2周后,處死動(dòng)物,小鼠脊髓進(jìn)行病理染色(HE和髓鞘染色),分離脾臟巨噬細(xì)胞,進(jìn)行巨噬細(xì)胞表型分析;(5)通過(guò)CBA方法檢測(cè)M2細(xì)胞回輸組與對(duì)照組高峰期M1/M2細(xì)胞分泌炎性/抗炎性細(xì)胞因子變化情況。(4)細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)分子NF-κb對(duì)于M1轉(zhuǎn)化至M2的作用:(1)觀(guān)察EAE小鼠,檢測(cè)病變不同時(shí)期脾臟中M1/M2的表型和功能,并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)EAE小鼠脊髓中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κb的表達(dá)水平;(2)EAE小鼠應(yīng)用NF-κb阻斷劑進(jìn)行預(yù)防和治療,治療后測(cè)定小鼠脊髓中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-κb的表達(dá)水平,同時(shí)對(duì)不同時(shí)期小鼠脊髓進(jìn)行病理染色(HE和髓鞘染色),同時(shí)取脾臟進(jìn)行M1與M2表型與功能測(cè)定,了解NF-κb對(duì)巨噬細(xì)胞的分化的影響,以此判斷細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)分子活性不足能否使巨噬細(xì)胞處于中間狀態(tài),從而不能進(jìn)一步分化成M1或M2。(3)通過(guò)CBA方法檢測(cè)NF-κb阻斷組與對(duì)照組不同發(fā)病時(shí)期M1/M2細(xì)胞分泌炎性/抗炎性細(xì)胞因子變化情況。(5)所有試驗(yàn)至少重復(fù)三次,獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間的計(jì)量資料的均數(shù)比較用t檢驗(yàn),比較EAE組與不同時(shí)期及與治療組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)果:(1)MOG-35-55和CFA混懸后皮下注射能夠有效地誘導(dǎo)C57BL/6小鼠成為EAE模型,在免疫后的第10天發(fā)病,第20天左右達(dá)高峰。(2)EAE組小鼠發(fā)病初期巨噬細(xì)胞增多(35.56±1.659%)其中M1比例增高(73.37±1.451%),M2比例較低(26.63±1.451%)隨著病情發(fā)展M1比例降低(56.16±1.297%),M2逐漸增高(43.84±1.297%),高峰期升至最高,恢復(fù)期M2下降。細(xì)胞因子TNF,IL-6,IL-17A在發(fā)病初期增高,發(fā)病高峰期降低。(3)應(yīng)用IL-4和M-CSF誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞分化M2巨噬細(xì)胞比例可達(dá)90%以上。(4)M2回輸治療組評(píng)分要低于EAE組(3.208±0.1145VS0.7500±0.3184),脾臟巨噬細(xì)胞減少,其中M2巨噬細(xì)胞減少明顯,細(xì)胞因子IL-6,IL-17A和TNF在EAE組要高于M2細(xì)胞回輸組。(5)應(yīng)用NF-κb阻斷劑后,小鼠脊髓中活性NF-κb活性降低。NF-κb預(yù)防組及NF-κb治療組小鼠癥狀均輕于EAE組。阻斷后小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞生成及消耗均減少。結(jié)論:(1)MOG35-55加FCA混合乳液可成功誘導(dǎo)C57BL/6小鼠EAE模型。(2)巨噬細(xì)胞參與了EAE的發(fā)病過(guò)程,M1有促炎作用,加重EAE癥狀,M2具有抗炎作用,使EAE癥狀緩解。(3)應(yīng)用IL-4和M-CSF能夠成功在小鼠骨髓干細(xì)胞上誘導(dǎo)出M2巨噬細(xì)胞。(4)M2巨噬細(xì)胞回輸減少小鼠脾臟巨噬細(xì)胞及促炎因子,可有效治療EAE,。(5)NF-κb阻斷劑BAY-11-7082可有效的阻斷NF-κb 65磷酸化,抑制了巨噬細(xì)胞的生成及消耗。(6)阻斷NF-κb通路可減輕EAE臨床癥狀。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R744.5
【圖文】：

圖 1.1 巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生及其分化巨噬細(xì)胞是非常重要的免疫細(xì)胞，它具有多種生物學(xué)功能，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞吞噬中起到了其他細(xì)胞不可替代的作用，它是先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，它不僅僅作用于人體的第一道防御，同時(shí)參與了后天防御系統(tǒng)的啟動(dòng)與調(diào)節(jié)。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生致炎的細(xì)胞因子與化學(xué)因子，包括腫瘤壞死因子α（TNF-α），趨化因子，白介素 1β（IL-1β）等，同時(shí)它還是最主要的吞噬細(xì)胞，參與清除了細(xì)胞凋亡細(xì)胞和組織碎片[26]。同時(shí)巨噬細(xì)胞通過(guò)表達(dá)抗炎因子（白介素 10，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，脂氧素等）對(duì)機(jī)體進(jìn)行進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。除了參與免疫反應(yīng)，巨噬細(xì)胞還在組織重構(gòu)方面發(fā)揮了重要的作用（乳腺，骨，腎臟，腦等）[27]，巨噬細(xì)胞的異常調(diào)節(jié)可導(dǎo)致自身免疫性疾病或炎癥的持續(xù)存在[28]。

圖 1.2 巨噬細(xì)胞的分型極化及其在 MS 中的作用1.3.2 巨噬細(xì)胞向 M2 方向轉(zhuǎn)化在體外，向巨噬細(xì)胞中加入 IFN-γ/脂多糖，可將其誘導(dǎo)成 M1 細(xì)胞, 而IL-4/IL-13 則可將其誘導(dǎo)成為 M2 細(xì)胞。然而，因?yàn)轶w內(nèi)同時(shí)存在細(xì)胞因子，并且著環(huán)境的變化可發(fā)生改變，因此在炎癥組織中，M1 和 M2 型細(xì)胞可同時(shí)存在。兩型細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)疾病的發(fā)展起著重要的作用，同時(shí)平衡的打破既有可能加劇 的癥狀，也有可能促進(jìn) EAE 病情的恢復(fù)[65]。在 EAE 中，選擇性輸入 CD206+M2 細(xì)胞可抑制 EAE 病情的發(fā)展，其機(jī)制可M2 的抗炎作用有關(guān)。用巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IIL-10、IL-13、TGF-β或地塞米松刺激巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可表達(dá)更多 CD206CD163[47,66,67]，同時(shí)在已經(jīng)激活的 M1 巨噬細(xì)胞上阻斷 CD28 或 CD40/CD40L 信號(hào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)里可減少 T 細(xì)胞的激活，減輕 EAE 的癥狀[68]。同時(shí)選擇性的消除星

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊元;陶濤;郭曉燕;袁正洲;呂志宇;李曉紅;李作孝;;血管活性腸肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織IFN-γ、IL-4因子含量的影響[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年01期

本文編號(hào)：2728112