發(fā)布時間：2020-06-23 04:40

【摘要】：目的:小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的固有免疫細胞,占中樞神經系統(tǒng)細胞總數(shù)的10%。小膠質細胞像哨兵一樣守護著中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的平衡,在正常狀態(tài)下,小膠質細胞通過由胞體伸出的突觸不斷運動以檢測周圍環(huán)境,及時發(fā)現(xiàn)腦內環(huán)境的變化,以維持腦內穩(wěn)態(tài)。研究表明,小膠質細胞在神經系統(tǒng)發(fā)育、維持中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)、免疫炎癥以及神經修復有重要作用。在急性缺血性腦卒中后,損傷的腦組織可以釋放出大量危險相關信號分子、氧自由基等,小膠質細胞針對腦內微環(huán)境的變化可以迅速活化,迅速增殖并遷移到損傷區(qū)域,產生多種促炎或者抗炎細胞因子,然而活化后的小膠質細胞影響缺血性腦卒中后炎癥反應的具體機制目前尚不明確。因此,了解小膠質細胞的作用機制對于調控卒中后小膠質細胞反應,從而減輕腦損傷有重要指導作用。Zinc finger E-box-binding homeobox 1(ZEB1)是哺乳動物中普遍存在的轉錄因子,在免疫系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展、腫瘤的發(fā)生以及腫瘤細胞耐藥性等方面發(fā)揮重要作用,影響多種病理生理功能。我們進行前期探索后發(fā)現(xiàn),急性缺血性腦卒中后ZEB1含量明顯升高,且主要來源是小膠質細胞。本實驗通過構建小膠質細胞特異性過表達或者低表達ZEB1的條件性轉基因小鼠,旨在探尋影響小膠質細胞中ZEB1在急性缺血性腦卒中后發(fā)揮作用的具體機制,這一研究將對完善小膠質細胞功能以及卒中后免疫炎癥機制提供新的證據(jù),為卒中后免疫治療提供新的思路。方法:(1)構建大腦中動脈缺血/再灌注模型,研究ZEB1含量的變化,并通過分離中樞神經系統(tǒng)的不同細胞來尋找ZEB1的主要細胞來源。(2)根據(jù)上述結果構建小膠質細胞特異性敲除(ZEB1-KD)或者過表達ZEB1(ZEB1-TG)小鼠,并誘導急性腦缺血/再灌注模型,通過神經功能評分、梗死體積、血腦屏障完整性、凋亡細胞數(shù)目來評價腦損傷程度,研究ZEB1對缺血性腦卒中的影響。(3)通過對小膠質細胞進行三維重建形態(tài)分析探究ZEB1對其靜息狀態(tài)下形態(tài)的影響;誘導缺血性腦卒中模型后研究條件性敲除或者過表達小鼠小膠質細胞的形態(tài),分析其活化程度。(4)在利用條件性敲除或過表達小鼠誘導缺血性腦卒中模型后,將中樞神經系統(tǒng)的小膠質細胞利用CX3CR1磁珠分選試劑盒進行分選后,對其進行基因芯片全基因組檢測后進行富集分析,分析其主要的影響的生物學功能。(5)利用流式細胞分析術(FACS)對條件性敲除與過表達小鼠中樞神經系統(tǒng)各個免疫細胞亞群進行分析。(6)通過免疫熒光染色和熒光定量PCR檢測條件性過表達或者敲除小鼠中樞神經系統(tǒng)趨化因子表達變化。(7)通過Transwell實驗研究中樞固有細胞(小膠質細胞,星形膠質細胞)對中性粒細胞的趨化作用,尋找ZEB1影響影響免疫細胞趨化的機制。(8)通過PCR檢測中樞神經系統(tǒng)分泌的炎癥因子的變化,利用不同炎癥因子的抗體中和其影響研究炎癥因子對中性粒細胞趨化的影響。(9)利用染色質免疫共沉淀技術和雙熒光素酶報告技術研究ZEB1影響炎癥因子表達的具體分子機制。(10)利用腺相關病毒對轉基因小鼠以及野生型小鼠進行腦實質注射以達到阻斷TGF-b1受體,誘導卒中模型,探究其神經功能評分以及梗死體積變化以及對中性粒細胞趨化的影響。結果:(1)在小鼠急性缺血性腦卒中后,在梗死側缺血半暗帶區(qū)域ZEB1的含量在m RNA水平和蛋白水平較健康側升高;進而分離出中樞神經系統(tǒng)的三種主要細胞—神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞后并對其進行氧糖剝奪,發(fā)現(xiàn)小膠質細胞中ZEB1升高最明顯。(2)分離出小膠質細胞并進行低氧低糖處理后,隨著低氧低糖時間的延長,ZEB1表達水平升高,恢復正常氧糖含量進行培養(yǎng)后,ZEB1含量恢復到基線水平。(3)利用構建的小膠質細胞中ZEB1過表達以及低表達小鼠進行缺血性腦卒中處理,結果顯示ZEB1-TG小鼠表臨床癥狀、梗死體積較野生型小鼠減輕,而ZEB1-KD小鼠臨床評分、梗死體積較野生型小鼠加重。在誘導缺血性卒中后,ZEB1-TG小鼠的凋亡細胞較野生型小鼠減少而ZEB1-KD小鼠的凋亡細胞增多;ZEB1-TG小鼠血腦屏障通透性較野生型小鼠改善,ZEB1-KD小鼠血腦屏障破壞更加嚴重。(4)通過分析小膠質細胞形態(tài)后發(fā)現(xiàn),ZEB1-TG小鼠的小膠質細胞突觸的復雜性較野生型小鼠增多;誘導缺血性卒中后,ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠以及野生型小鼠活化的小膠質細胞數(shù)目、突出長度、阿米巴狀細胞比例無明顯差異;通過對小膠質細胞胞體長度(L)以及面積(A)比例的分析來測量其活化程度,ZEB1-TG小膠質細胞活化程度較野生型小膠質細胞減低,ZEB1-KD小膠質細胞表現(xiàn)出相反的趨勢;ZEB1-TG、ZEB1-KD、野生型小鼠的小膠質細胞增殖凋亡數(shù)目無明顯差異。(5)誘導缺血性腦卒中后,將ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠、野生型小鼠的小膠質細胞分離出來進行基因芯片分析,三者有不同的基因表達譜;對差異基因進行富集分析后,主要富集的通路集中在免疫功能上。(6)對ZEB1-TG小鼠、ZEB1-KD小鼠、野生型小鼠進行免疫細胞亞群分析后發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后浸潤到中樞的中性粒細胞存在最明顯的差異。(7)ZEB1-TG小鼠在誘導缺血性卒中后,中性粒細胞趨化因子CXCL1含量較野生型小鼠明顯減低,且CXCL1主要存在于星形膠質細胞中。(8)在Transwell實驗中,星形膠質細胞單獨存在的情況下ZEB1-TG小鼠和野生型小鼠對于中性粒細胞的趨化能力并無明顯差別;當小膠質細胞和星形膠質細胞共同存在的情況下,ZEB1-TG小膠質細胞和星形膠質細胞對于中性粒細胞的趨化能力明顯下降,CXCL1的含量明顯降低。此抑制作用主要是由于過表達小膠質細胞可以分泌較多的TGF-β1導致的。(9)ZEB1可以和TGF-β1啟動子區(qū)域結合,激活TGF-β1的轉錄。(10)將sh TGF-b RⅡ腺相關病毒腦實質注射后,阻斷星形膠質細胞的TGF-β1信號通路,此時誘導缺血性腦卒中模型,ZEB1-TG小鼠與野生型小鼠梗死體積、臨床評分、對中性粒細胞趨化能力無明顯差別。結論:ZEB1在急性缺血性腦卒中后表達水平明顯升高,在小膠質細胞中尤為明顯。在小膠質細胞中過表達ZEB1可以減輕急性缺血性腦卒中后的腦損傷;過表達ZEB1的小膠質細胞突觸的復雜性以及缺血性腦卒中后的免疫調節(jié)功能顯著增高;ZEB1改善卒中預后的機制可能是由于改善卒中后炎癥微環(huán)境導致的。ZEB1高表達的小膠質細胞可分泌大量的TGF-β1,抑制星形膠質細胞分泌中性粒細胞趨化因子CXCL1,降低了急性期中性粒細胞向中樞神經系統(tǒng)的浸潤;而敲低ZEB1則會加重缺血性腦卒中損傷�；诖藢嶒灲Y果我們推斷ZEB1是缺血性腦卒中后小膠質細胞調控炎癥反應的重要因子,有可能成為卒中后免疫干預的重要靶點。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

34圖 1：ZEB1 在卒中后表達水平升高且主要表達在小膠質細胞中。2.2 小膠質細胞中高表達 ZEB1 減輕了缺血性腦卒中損傷2.2.1 構建小膠質細胞過表達以及低表達 ZEB1 小鼠為研究小膠質細胞中 ZEB1 表達水平對于缺血性腦卒中的影響，我們利用Cre-loxP 系統(tǒng)成功構建 ZEB1 在小膠質細胞中特異性高表達（transgenic, [TG];ZEB1-TG）和低表達（knockdown [KD]; ZEB1-KD）小鼠。首先，我們構建了兩種 loxp 小鼠：（1）Zeb1-TG 小鼠,在 zeb1 編碼基因的終止子兩側插入兩個 loxp位點；（2）Zeb1-KD 小鼠，在 zeb1 編碼基因 4 號外顯子兩端插入兩個 loxp 位點（圖 2A），并使用 flp 小鼠將 NEO 刪除。第二步，使用小膠質細胞特異性 Cre小鼠--CX3CR1CreER小鼠與上述兩種 loxp 小鼠雜交，產生 ZEB1-TG 和 ZEB1-KD小鼠（圖 2B）。接下來檢測兩種條件性轉基因小鼠是否構建成功。通過鼠尾鑒定選擇 Cre 與 loxp 雙陽性小鼠，并選擇其同窩 Cre 陰性的小鼠作為對照小鼠，每

只小鼠給予 20mg 他莫昔芬灌胃以誘導 Cre 酶發(fā)揮作用，每次 10mg，隔一天灌胃一次。4 周后，分離中樞小膠質細胞和外周單核細胞，分別在 RNA 和蛋白水平檢測 ZEB1 含量。結果顯示在 ZEB1-TG 小鼠的小膠質細胞中，ZEB1 在 RNA與蛋白水平均較野生型小膠質細胞升高，ZEB1-KD 小鼠的小膠質細胞 ZEB1 水平較野生型小膠質細胞降低。而對于外周的單核細胞，ZEB1 表達水平在三種小鼠并無明顯差別（圖 2C,D）。以上結果說明小膠質細胞特異性 ZEB1 過表達和低表達小鼠構建成功。

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本文編號：2726810