【摘要】：[目的]體外研究神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均過表達(dá)Nurr1基因后在Transwell共培養(yǎng)中的相互作用及影響。[方法]1.原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):取新生24-48小時內(nèi)的SD大鼠大腦皮層組織,用角膜剪將腦組織切碎,然后用2 mL的胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.02%)進(jìn)行酶解。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(1:1)中止消化,用70μm細(xì)胞濾器過濾后獲得單細(xì)胞懸液。按5×106/mL的細(xì)胞密度接種后在小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)液中培養(yǎng),混合培養(yǎng)14天后通過拍打法分離純化,并經(jīng)CD11b免疫熒光鑒定。2.原代神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng):取孕12.5-14.5天的SD大鼠胎鼠,解剖分離獲取中腦腹側(cè)組織。用角膜剪剪碎后用1mL滅菌移液管反復(fù)機(jī)械吹打數(shù)次,經(jīng)70μm細(xì)胞濾器過濾獲得單細(xì)胞懸液。按2×105/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶,加入含表皮生長因子(epidermal grouth factor,EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液(EGF與bFGF終濃度均為20ng/mL)。神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)7天后離心收集神經(jīng)球,進(jìn)行免疫熒光鑒定及分化培養(yǎng)鑒定。3.設(shè)計Nurr1基因引物并經(jīng)PCR擴(kuò)增,利用Xba Ⅰ和Not Ⅰ酶切基因Nurr1和載體 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(或 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP),利用T4連接酶把己酶切的基因Nurr1和己酶切的載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(或 pCDH-CMV-MCS-EF1-copRFP)連接起來,完成慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。最終獲得慢病毒載體pCDH-copRFP-Nurr1及pCDH-copGFP-Nurr1,分別用于神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的慢病毒感染。4.構(gòu)建Transwell共培養(yǎng)體系:Transwell上室用于小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng),下室用于神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)。將神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分成以下6組進(jìn)行共培養(yǎng):神經(jīng)干細(xì)胞單獨培養(yǎng)組(mNSC組,Control組)、神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組(mNSC+MG組)、神經(jīng)干細(xì)胞與過表達(dá)Nurr1的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組(mNSC+NMG組)、過表達(dá)Nurr1的神經(jīng)干細(xì)胞組(NmNSC組)、過表達(dá)Nurr1的神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組(NmNSC+MG組)和過表達(dá)Nurr1的神經(jīng)干細(xì)胞與過表達(dá)Nurr1的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組(NmNSC+NMG組)。培養(yǎng)3,6和9天后分別收集各組mNSC,應(yīng)用Western blot,RT-PCR及免疫熒光檢測各組Otx2,Pitx3,TH和DAT的表達(dá)情況。[結(jié)果]1.體外成功培養(yǎng)原代神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光鑒定神經(jīng)干細(xì)胞Nestin陽性,分化培養(yǎng)后分化細(xì)胞分別呈Tuj1和GFAP陽性。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定呈CD1 1b陽性。2.經(jīng)慢病毒感染成功使神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞分別過表達(dá)Nurr1基因,神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Nurr1基因后分化成DA神經(jīng)元的比例增加;小膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)Nurr1基因后炎癥因子分泌減少,神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌增加。3.在Transwell神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中,神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合過表達(dá)Nurr1基因組DA神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物(Otx2,Pitx3,TH和DAT)較其余實驗組明顯表達(dá)增多,說明神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞均過表達(dá)Nurr1基因后共培養(yǎng),可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向DA神經(jīng)元分化。[結(jié)論]Nurr1基因在體外神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中,能增加小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌,減少炎癥因子分泌,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向DA神經(jīng)元分化。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R742.5
【圖文】：

５．神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的Ｉｔａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)逡逑５．１邋Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)小室逡逑在本研究中，我們采用Ｃｏｍｉｎｇ２４孔板Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)小室（結(jié)構(gòu)圖見圖２）逡逑進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞的體外共培養(yǎng)。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上、下小室間膜的孔徑逡逑為０．４ｍｍ，細(xì)胞不能透過，而細(xì)胞分泌的一些因子能透過此孔徑，從而相互作用。逡逑在本實驗中，我們將小膠質(zhì)細(xì)胞置于上層小室（４．５ｘｌ０５／ｍＬ），神經(jīng)千細(xì)胞置于逡逑下層小室（１．５ｘｌ0５／ｍＬ）。逡逑５．２神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)過程逡逑將神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分成以下６組進(jìn)行共培養(yǎng)：神經(jīng)干細(xì)胞單獨逡逑培養(yǎng)組（ｍＮＳＣ組，Ｃｏｎｔｒｏｌ組）、神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組（ｍＮＳＣ＋ＭＧ逡逑組）、神經(jīng)干細(xì)胞與過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組（ｍＮＳＣ＋ＮＭＧ組）、過逡逑表達(dá)Ｎｕｒｒｌ的神經(jīng)干細(xì)胞組（ＮｍＮＳＣ組）、過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ的神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)逡逑細(xì)胞共培養(yǎng)組（ＮｍＮＳＣ＋ＭＧ組）和過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ的神經(jīng)干細(xì)胞與過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ逡逑的小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)組（ＮｍＮＳＣ＋ＮＭＧ組）。根據(jù)Ｚｕｊｏｖｉｃ，Ｖ．等的研宄［２８］，我們逡逑將神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ共培養(yǎng)的比例定為２：１，分別將細(xì)胞接種于逡逑上下小室。神經(jīng)干細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞分別共培養(yǎng)３，６和９天后收集下室的神經(jīng)干逡逑細(xì)胞，應(yīng)用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ，ＲＴ－ＰＣＲ及免疫熒光檢測各組神經(jīng)干細(xì)胞間Ｏｔｘ２，邋Ｐｉｔｘ３，逡逑ＴＨ和ＤＡＴ的表達(dá)情況。逡逑

神經(jīng)干細(xì)胞（神經(jīng)球）經(jīng)慢病毒感染培養(yǎng)７２小時后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)逡逑現(xiàn)，大部分神經(jīng)球均表達(dá)綠色熒光（ＧＦＰ），且其中有些神經(jīng)球已漸自行貼壁分逡逑化（圖４Ａ－Ｂ）。為進(jìn)一步檢測過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，我們分別逡逑用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ及ＲＴ－ＰＣＲ檢測Ｎｕｒｒｌ組及空載體組間Ｎｕｒｒｌ、ＴＨ及ＤＡＴ表達(dá)情逡逑況。實驗數(shù)據(jù)表明，與空載體組相比較，Ｎｕｒｒｌ組Ｎｕｒｒｌ的ｘｎＲＮＡ及蛋白水平表逡逑達(dá)均明顯上調(diào)，有統(tǒng)計學(xué)差異（圖４Ｃ－Ｆ）。說明神經(jīng)千細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染７２小逡逑時后成功過表達(dá)了邋Ｎｕｒｒｌ。除了邋Ｎｕｒｒｌ水平外，我們進(jìn)一步用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ及逡逑ＲＴ－ＰＣＲ檢測ＴＨ及ＤＡＴ在兩組間的表達(dá)情況，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ＴＨ及ＤＡＴ在Ｎｕｒｒｌ逡逑組的表達(dá)水平也均上調(diào)，說明神經(jīng)干細(xì)胞過表達(dá)Ｎｕｒｒｌ后其分化成的ＤＡ神經(jīng)元逡逑比例也相應(yīng)上調(diào)（圖５）。逡逑２４逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李燕;郭勇;徐富翠;;神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)影響因素的研究[J];西南軍醫(yī);2010年02期

本文編號：2725350