【摘要】：研究背景:癲癇(epilepsy)和抗癲癇藥物(Anti-epileptic drug,AEDs)對患兒都可以帶來很多不良影響,對于抗癲癇治療的耐受性,依從性和長期維持都有不利地影響,特別是對認知功能的不良作用。目前研究證實生酮飲食(Ketogenic Diet,KD)對難治性癲癇兒童的治療有效且耐受性較好,截至目前并沒有KD對認知或行為方面的不良影響的相關(guān)報道。多個研究提示生酮飲食的抗癲癇作用可能與酮體的神經(jīng)保護作用有關(guān),因此尋找具有抗氧化性的神經(jīng)保護化合物不僅能夠為癲癇的治療帶來新的思路,同時可以為進一步了解神經(jīng)保護作用的調(diào)控機制打好基礎(chǔ)。由于癲癇發(fā)作和AEDs對患兒認知都有不利影響,因此我們的臨床觀察研究側(cè)重于了解生酮飲食對認知功能的保護作用。研究顯示,大約78%的酮體是β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA),但是BHBA抗癲癇的功能和機制尚不不能確認,因此本課題重點探討了 BHBA對難治性癲癇小鼠模型認知功能的恢復(fù)作用,擬在進一步揭示BHBA如何防治癲癇發(fā)作發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究分為兩個部分:第一部分通過觀察KD(改良Atkins方案)對難治性癲癇患兒治療前后腦電圖和認知功能的變化,進行統(tǒng)計分析,明確改良Atkins飲食方法改善兒童難治性癲癇的臨床發(fā)作、腦電圖和認知功能的作用。第二部分應(yīng)用Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)實驗,對實驗癲癇小鼠神經(jīng)行為和病理學(xué)進行檢測,測定海馬組織中ROS、MDA、SOD和GSH-Px的水平和活性,探討B(tài)HBA對癲癇發(fā)作介導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護作用。通過Bcl-2及Bax基因蛋白表達檢測,觀察BHBA對對海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響,進一步觀察AMPK/PPAR α信號通路在BHBA修復(fù)氧化應(yīng)激損傷從而保護神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。第一部分改良Atkins生酮飲食添加對兒童難治性癲癇的認知功能的影響目的:通過統(tǒng)計分析改良Atkins生酮飲食添加治療前后認知功能、智力測試量表和腦電波形的變化,研究改良Atkins生酮飲食添加對兒童難治性癲癇臨床癥狀、腦電圖癲癇樣放電數(shù)量、腦電波相對功率以及智力的改善作用,確定改良Atkins飲食添加治療對于難治性癲癇的療效。方法:研究對象為2015～2018年兒科就診的難治性癲癇的患兒,采用隨機數(shù)字表法隨機分組:實驗組:32例,均采用抗癲癇藥物添加改良的Atkins生酮飲食方案(KD+AEDs)聯(lián)合治療方法;對照組:28例,均單獨采用抗癲癇藥物(AEDs)治療。收集患者基本資料,包括:年齡、性別以及所服用的AEDs。實驗組和對照組分別在治療前、治療6個月后進行24小時動態(tài)觀察腦電圖,智力測試(韋氏兒童智力測試法),記錄癲癇發(fā)作次數(shù)。根據(jù)臨床發(fā)作次數(shù)的減少情況進行臨床治療效果判定,有無發(fā)作間期(生酮治療后)癲癇樣放電評價腦電圖,計算腦電監(jiān)測各個波段(α、β、θ、δ)的相對功率,FIQ劃分智力等級。本研究獲得了山東大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準,取得患兒監(jiān)護人的知情同意并簽署知情同意書。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義:符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用成組t檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗;非正態(tài)分布的計量資料以M(P25,P75)表示;計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗;腦電波相對功率改變與韋氏智力測試的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果:1.對照組臨床治療總有效率71.42%(20/28),實驗組臨床治療總有效率96.87%(31/32),實驗組臨床總有效率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05(χ2=6.405,P=0.011)。2.實驗組、對照組腦電圖IEDs變化總有效率分別為93.75%(30/32)、78.57%(22/28),實驗組腦電圖IEDs變化總有效率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05(χ2=7.428,P=0.007)。3.對照組與實驗組α、β、δ、θ波段相對功率治療前后的差值對比結(jié)果表明,組間差異一律p0.05。在經(jīng)過生酮飲食治療6個月后,對照組相對功率(θ波段)大于實驗組,生酮飲食未添加的對照組α、β波段相對功率低于實驗組,P0.05;和治療前相比,對照組樣本病例(生酮飲食未添加)治療后β波段相對功率更小,P0.05;和治療前相比,實驗組β波段相對功率治療后更高,P0.05。實驗組和對照組的兩組患兒在治療6個月之后,和治療前相比,α波段相對功率值更高,δ波段、0波段相對功率值更低,P0.05。4.實驗組經(jīng)過6個月生酮飲食添加臨床治療后FIQ、PIQ、VIQ顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.實驗組治療前α、β波段相對功率與FIQ呈正相關(guān)。6.實驗組治療前后FIQ差異Δ FIQ與治療前后α波段相對功率的差異、β波段相對功率的差異(Δ α、Δ β)呈負相關(guān),無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1.改良Atkins生酮飲食添加對兒童難治性癲癇顯著改善臨床癥狀,可以改善EEG的神經(jīng)電生理指標(發(fā)作間期放電指數(shù)和腦電波相對功率),可以改善患兒的認知功能。2.改良Atkins生酮飲食添加治療兒童難治性癲癇時,EEG背景快活動(α、β波段)和認知功能的改善呈正相關(guān),有相關(guān)性�？旎顒�(α、β波段)的變化與認知功能的變化沒有相關(guān)性。第二部分β-羥丁酸對癲癇小鼠的神經(jīng)保護作用目的:KD的標志性特征就是脂肪酸氧化產(chǎn)生酮體(Ketone body,KB),而酮體的主要成分是BHBA。本部分通過對癲癇小鼠模型進行神經(jīng)行為學(xué)和神經(jīng)元海馬組織病理學(xué)檢測,包括Morris水迷宮實驗(Morris water maze,MWM)和測定海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)因子ROS、MDA、SOD、GSH-Px的活性,探討B(tài)HBA對癲癇介導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激的保護機制。研究Bcl-2/Bax蛋白表達對小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的保護作用,觀察探討B(tài)HBA對細胞凋亡的影響。將從AMPK信號通路入手,初步揭示BHBA通過干預(yù)AMPK信號通路抑制細胞凋亡介導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷從而發(fā)揮保護作用機制,進一步探討過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在BHBA處理后的抗驚厥作用中的作用。為臨床的治療和新的藥物的研制提供基礎(chǔ)理論,為生酮飲食的研究提供線索。方法:實驗動物隨機分為3組(每組15只):正常組、癲癇組、β-羥丁酸組。癲癇組:采用氯化鋰-匹羅卡品建模方法建立癲癇模型;β-羥丁酸組:采用氯化鋰-匹羅卡品建模方法建立癲癇模型誘發(fā)癲癇后按300 mg/kg/day的劑量給予腹腔注射β-羥丁酸溶液。1.Morris水迷宮實驗(Morris water maze,MWM),實驗動物進行五天的學(xué)習(xí)階段。在此階段,觀察小鼠在水中60 s后能否找到平臺。第6天,移除平臺。使用攝像機記錄鼠標穿過平臺的次數(shù)和60秒時間內(nèi)目標象限所用時間的百分比。兩次實驗間隙,每只小鼠休息至少30分鐘。2.獲取各組小鼠神經(jīng)海馬組織,通過固定、脫水、包埋制作4-5um石蠟切片進行Nissl和Tunel染色,對小鼠神經(jīng)元海馬組織病進行病理學(xué)檢測,顯微鏡下觀察染色效果,并拍照。3.檢測各組海馬組織中ROS和MDA的水平,以及SOD和GSH-Px的活性。4.Western blots 檢測各組小鼠腦組織 p-AMPK,AMPK、PPAR α、Bcl-2 及Bax等蛋白的表達。結(jié)果:l.Morris水迷宮實驗:與對照組小鼠相比,癲癇小鼠在獲得階段的逃逸潛伏期顯著增加,在BHBA治療后這種行為減弱。在第6天的探針試驗中,與對照小鼠相比,癲癇小鼠穿過平臺的頻率更低,在目標象限的時間更短。BHBA治療顯著延長了癲癇小鼠靶區(qū)的時間。2.癲癇后Nissl和Tunel染色顯示海馬神經(jīng)元明顯丟失和凋亡。經(jīng)BHBA治療后,海馬區(qū)內(nèi)整合神經(jīng)元增多,凋亡細胞減少。3.BHBA減弱了由癲癇引起的海馬中ROS和MDA的過度產(chǎn)生。4.與對照組相比,癲癇小鼠海馬組織中SOD和GSH-Px的活性被減弱,并且β-羥丁酸組部分但顯著地被給予BHBA增強。5.與對照組相比,Western blots顯示癲癇小鼠海馬中bcl-2蛋白的下調(diào)和Bax蛋白的上調(diào)。6.與對照組小鼠相比,癲癇小鼠海馬中AMPK磷酸化和PPARα的蛋白表達出現(xiàn)了降低,BHBA治療后海馬中的PPARα明顯恢復(fù)。結(jié)論:1.BHBA改善癲癇介導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)缺陷,改善癲癇所致海馬神經(jīng)損傷,可以預(yù)防癲癇介導(dǎo)的海馬氧化應(yīng)激,可以改善癲癇引起的細胞凋亡。2.BHBA可能通過激活A(yù)MPK信號通路發(fā)揮其保護作用,PPAR α的調(diào)節(jié)可能參與了 BHBA的抗癲癇作用
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1
【圖文】：

組治療前ｐ波段相對功率與ＦＩＱ逡逑Ｒ＝０．５５４逡逑１１0１邐Ｐ＜０．０１逡逑１０５－逡逑ｇ邋１００－邐？邋？逡逑？邋？逡逑９５－邐？邋？邐？邐＃邋？逡逑９０＿邐｜邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐５邐１０邐１５逡逑治療前ＰＭ逡逑

實驗組Ａ邋ＦＩＱ與Ａ邋Ｐ波段相對功率關(guān)系的散點圖逡逑？？？？？？邋邋邋———邋邐邐邐邐邐－邐邐逡逑ＦＩＱ薪逡逑－５－逡逑？？邐？邐５邐－逡逑Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑－１５邐－１０邐－５邐０邐５逡逑Ｐ波段薪逡逑

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