【摘要】：第一部分:Sema7A在顳葉癲癇患者及戊四氮癲癇模型大鼠腦組織中的表達研究目的:主要檢測Sema7A在顳葉癲癇患者腦組織標本以及戊四氮點燃癲癇模型大鼠腦組織標本中的表達情況。方法:1.從臨床收取的診斷為難治性顳葉癲癇患者術后切除腦組織中按照隨機抽取原則選取16例標本作為人癲癇組腦組織,同時選取12例不伴有癲癇病史的顱腦外傷患者術后顳葉腦組織標本作為人對照顳葉腦組織。2.選取成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,隨機分為生理鹽水對照組和戊四氮慢性點燃癲癇造模組,其中被點燃成功的SD大鼠被選取作為癲癇組。3.使用免疫印跡技術、免疫組織化學、免疫熒光技術檢測Sema7A在顳葉癲癇患者及戊四氮慢性癲癇模型大鼠腦組織中的表達變化。結果:1.Sema7A在顳葉癲癇患者腦組織中和慢性癲癇模型大鼠腦組織中均有較豐富的表達,且主要表達在神經(jīng)元細胞的胞漿和胞膜中。2.在人顳葉癲癇腦組織中,Sema7A的表達水平明顯高于非癲癇對照組(p0.05)。3.在戊四氮慢性點燃癲癇大鼠模型的海馬及顳葉腦組織中,點燃組的Sema7A表達水平均明顯高于生理鹽水對照組(p0.05)。結論:Sema7A豐富表達于人及大鼠顳葉和海馬腦組織的神經(jīng)元細胞胞漿和胞膜中。顳葉癲癇患者及慢性癲癇大鼠腦組織中,Sema7A的表達水平較對照組相比均明顯增高,提示Sema7A可能在癲癇的發(fā)生發(fā)展中有一定的相關性,發(fā)揮了一定的作用。第二部分Sema7A在癲癇中的作用研究目的:通過顱內轉染慢病毒載體干擾抑制和過表達Sema7A,檢測慢病毒載體的作用效率及穩(wěn)定性;觀察慢病毒干擾抑制或過表達Sema7A后,慢性癲癇大鼠行為學的變化;觀察Sema7A作為軸突導向分子,對慢性癲癇大鼠海馬中主要軸突苔蘚纖維投射出芽的影響。方法:1.分別構建含有Sema7A-RNAi序列的干預慢病毒載體(Lentiviral vector,LV)和含有Sema7A過表達基因片段的慢病毒載體,通過顱內定位注射的方法轉染到SD大鼠海馬DG(Dentate Gyrus)區(qū)的神經(jīng)元細胞,分別干預抑制和過表達大鼠海馬區(qū)的Sema7A表達水平。通過免疫印跡技術、免疫熒光來分別驗證Sema7A是否轉染成功,轉染的效率及穩(wěn)定性。2.選取雄性SD成年大鼠,隨機分組為癲癇干預對照組(Con-RNAi)、癲癇干預組(Sema7A-RNAi)、癲癇過表達對照組(Con-Sema7A)、癲癇過表達組(Sema7A),分別用相應慢病毒進行大鼠海馬DG區(qū)定位注射。3.注射病毒后,每日腹腔注射戊四氮(35mg/kg)構建慢性點燃癲癇大鼠模型,觀察統(tǒng)計造模過程中癲癇大鼠的行為學改變,包括出現(xiàn)第一次4或5級癲癇發(fā)作的潛伏期,4和5級癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時間,4或5級癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)。4.注射干預和過表達病毒的戊四氮點燃癲癇大鼠模型后,再次給予顱內DG區(qū)定位注射生物素標記地葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)進行順性軸突示蹤,觀察海馬苔蘚樣纖維生長投射受不同水平Sema7A的影響。結果:1.轉染干預和過表達慢病毒載體后,通過免疫熒光結果可見慢病毒載體成功轉染了大鼠海馬DG區(qū)的神經(jīng)元細胞;免疫印跡實驗結果提示,注射Sema7A-RNAi抑制慢病毒載體后14天和42天,Sema7A的表達水平與Con-RNAi對照組相比明顯下降,注射Sema7A過表達慢病毒載體后14天和42天,Sema7A的表達水平與Con-Sema7A對照組相比明顯增高(p0.05)。2.在戊四氮慢性點燃癲癇大鼠模型中,下調Sema7A的表達水平可以使第一次4或5級癲癇發(fā)作的潛伏期明顯延長,使4和5級癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時間明顯減少,4和5級癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)明顯減少;而過表達Sema7A可以使第一次4或5級癲癇發(fā)作的潛伏期明顯縮短,使4和5級癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時間明顯延長,4和5級癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)明顯增多(p0.05)。3.敲低癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達水平,可以使海馬區(qū)苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)的投射數(shù)量明顯減少;過表達癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達,可以使海馬區(qū)苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)的異常生長,投射數(shù)量明顯增多,且向外層發(fā)芽(p0.05)。結論:1.Sema7A-RNAi和Sema7A慢病毒載體均可以成功敲低和過表達SD大鼠海馬DG區(qū)Sema7A的表達水平;2.敲低Sema7A水平可以降低大鼠癲癇發(fā)作的易感性,相反過表達Sema7A水平可以提高大鼠癲癇發(fā)作的易感性,Sema7A可以促進癲癇發(fā)作。3.在癲癇大鼠中,Sema7A可以影響苔蘚纖維生長,促進苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)異常生長投射并發(fā)芽。第三部分Sema7A在癲癇中的作用機制目的:過去研究認為Sema7A可以通過MAPK通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。因此我們認為在癲癇中Sema7A可能也通過MAPK通路來發(fā)揮作用,調節(jié)癲癇的易感性。本部分主要探討Sema7A是否通過ERK通路調節(jié)癲癇大鼠海馬腦組織中的炎癥反應及軸突苔蘚纖維生長。方法:1.選取雄性SD成年大鼠,隨機分組為癲癇干預對照組(Con-RNAi)、癲癇干預組(Sema7A-RNAi)、癲癇過表達對照組(Con-Sema7A)、癲癇過表達組(Sema7A),分別用相應慢病毒進行大鼠海馬DG區(qū)定位注射。2.使用免疫印跡方法檢測在過表達和敲低戊四氮癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達水平后,下游通路ERK1/2磷酸化水平,以及下游炎癥因子白介素6(interleukin-6,IL-6),腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)在不同組之間的表達變化。5.將Sema7A過表達慢病毒定位注射在大鼠海馬DG區(qū),將過表達Sema7A組和過表達對照組的癲癇大鼠給予每日腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制劑U0126(30mg/kg)抑制ERK1/2磷酸化水平,觀察統(tǒng)計造模過程中癲癇大鼠的行為學改變,包括出現(xiàn)第一次4或5級癲癇發(fā)作的潛伏期,4和5級癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時間,4或5級癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)。6.檢測給予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A過表達組和過表達對照組下游炎癥因子IL-6,TNF-α在不同組之間的表達變化。7.檢測給予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A過表達組和過表達對照組給予顱內DG區(qū)定位注射生物素葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)進行順性軸突示蹤,觀察海馬苔蘚樣纖維生長投射受不同水平Sema7A的影響。結果:1.在戊四氮慢性點燃癲癇大鼠模型中,敲低Sema7A可以使ERK1/2的磷酸化水平,而過表達Sema7A則可以使ERK1/2的磷酸化水平明顯上調(p0.05)。說明Sema7A的表達水平和ERK1/2的磷酸化水平正性相關。2.敲低Sema7A可以使癲癇大鼠海馬腦組織中的炎性因子IL-6,TNF-α水平明顯降低,而過表達Sema7A則可以使IL-6,TNF-α水平明顯增高(p0.05)。3.給予U0126抑制劑明顯地降低了癲癇大鼠過表達Sema7A對ERK1/2磷酸化水平的上調作用(p0.05)。4.抑制劑U0126明顯抑制了癲癇大鼠過表達Sema7A對炎癥因子IL-6和TNF-α的正性上調作用,使兩種炎性因子的表達水平較過表達組明顯降低(p0.05)。5.過表達Sema7A的癲癇大鼠給予抑制劑U0126后,通過BDA神經(jīng)示蹤發(fā)現(xiàn),該組的苔蘚纖維生長較過表達組明顯減少,從大鼠海馬門區(qū)向CA3區(qū)投射的苔蘚纖維數(shù)量變少(p0.05)。結論:1.在癲癇大鼠腦組織中,上調或下調Sema7A可以引起ERK1/2磷酸化水平,炎癥因子IL-6,TNF-α的水平改變,提示Sema7A可能通過ERK1/2通路實現(xiàn)對癲癇中炎癥反應的調控。2.U0126可以抑制EKR1/2磷酸化水平,抑制Sema7A對癲癇大鼠行為學的影響,以及對IL-6及TNF-α水平的上調作用。同時U0126可以抑制Sema7A對癲癇大鼠海馬苔蘚纖維的生長。提示在癲癇大鼠中,Sema7A影響神經(jīng)炎癥反應及苔蘚纖維生長的作用機制是通過對ERK磷酸化通路調控來實現(xiàn)的。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.1
【圖文】：

35圖 1-1. Sema7A 在 TLE 患者和對照組患者中的表達分析Fig1-1. Sema7A expression in TLE patients and nonepileptic patients.（a）Sema7A 在 TLE 患者和對照組患者中的免疫熒光代表圖。Sema7A（綠色）和 NSE（紅

圖 1-2. PTZ 點燃模型大鼠的 LFP 驗證。Fig1-2. LFP recordings from rats after PTZ kindling.驗過程的示意圖。給予點燃大鼠最后一次 PTZ 注射后將電極植入背側海馬P。（b）來自成功點燃的大鼠代表性的 LFP 腦電記錄圖（基線，發(fā)作間期和期和發(fā)作期均檢測到癲癇波，證明 PTZ 模型成功。ematic diagram of the experimental design. The electrodes were implantedhippocampus after the last PTZ injection, and then the LFP was recontative LFP recording from a successfully kindled rat. The baseline, intericta were recorded. Seizure spikes were detected in both the interictal and ictaeans that the PTZ models are successful.

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本文編號：2721030