【摘要】：第一部分:Sema7A在顳葉癲癇患者及戊四氮癲癇模型大鼠腦組織中的表達(dá)研究目的:主要檢測Sema7A在顳葉癲癇患者腦組織標(biāo)本以及戊四氮點(diǎn)燃癲癇模型大鼠腦組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。方法:1.從臨床收取的診斷為難治性顳葉癲癇患者術(shù)后切除腦組織中按照隨機(jī)抽取原則選取16例標(biāo)本作為人癲癇組腦組織,同時(shí)選取12例不伴有癲癇病史的顱腦外傷患者術(shù)后顳葉腦組織標(biāo)本作為人對(duì)照顳葉腦組織。2.選取成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組和戊四氮慢性點(diǎn)燃癲癇造模組,其中被點(diǎn)燃成功的SD大鼠被選取作為癲癇組。3.使用免疫印跡技術(shù)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光技術(shù)檢測Sema7A在顳葉癲癇患者及戊四氮慢性癲癇模型大鼠腦組織中的表達(dá)變化。結(jié)果:1.Sema7A在顳葉癲癇患者腦組織中和慢性癲癇模型大鼠腦組織中均有較豐富的表達(dá),且主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿和胞膜中。2.在人顳葉癲癇腦組織中,Sema7A的表達(dá)水平明顯高于非癲癇對(duì)照組(p0.05)。3.在戊四氮慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠模型的海馬及顳葉腦組織中,點(diǎn)燃組的Sema7A表達(dá)水平均明顯高于生理鹽水對(duì)照組(p0.05)。結(jié)論:Sema7A豐富表達(dá)于人及大鼠顳葉和海馬腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞胞漿和胞膜中。顳葉癲癇患者及慢性癲癇大鼠腦組織中,Sema7A的表達(dá)水平較對(duì)照組相比均明顯增高,提示Sema7A可能在癲癇的發(fā)生發(fā)展中有一定的相關(guān)性,發(fā)揮了一定的作用。第二部分Sema7A在癲癇中的作用研究目的:通過顱內(nèi)轉(zhuǎn)染慢病毒載體干擾抑制和過表達(dá)Sema7A,檢測慢病毒載體的作用效率及穩(wěn)定性;觀察慢病毒干擾抑制或過表達(dá)Sema7A后,慢性癲癇大鼠行為學(xué)的變化;觀察Sema7A作為軸突導(dǎo)向分子,對(duì)慢性癲癇大鼠海馬中主要軸突苔蘚纖維投射出芽的影響。方法:1.分別構(gòu)建含有Sema7A-RNAi序列的干預(yù)慢病毒載體(Lentiviral vector,LV)和含有Sema7A過表達(dá)基因片段的慢病毒載體,通過顱內(nèi)定位注射的方法轉(zhuǎn)染到SD大鼠海馬DG(Dentate Gyrus)區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞,分別干預(yù)抑制和過表達(dá)大鼠海馬區(qū)的Sema7A表達(dá)水平。通過免疫印跡技術(shù)、免疫熒光來分別驗(yàn)證Sema7A是否轉(zhuǎn)染成功,轉(zhuǎn)染的效率及穩(wěn)定性。2.選取雄性SD成年大鼠,隨機(jī)分組為癲癇干預(yù)對(duì)照組(Con-RNAi)、癲癇干預(yù)組(Sema7A-RNAi)、癲癇過表達(dá)對(duì)照組(Con-Sema7A)、癲癇過表達(dá)組(Sema7A),分別用相應(yīng)慢病毒進(jìn)行大鼠海馬DG區(qū)定位注射。3.注射病毒后,每日腹腔注射戊四氮(35mg/kg)構(gòu)建慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠模型,觀察統(tǒng)計(jì)造模過程中癲癇大鼠的行為學(xué)改變,包括出現(xiàn)第一次4或5級(jí)癲癇發(fā)作的潛伏期,4和5級(jí)癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時(shí)間,4或5級(jí)癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)。4.注射干預(yù)和過表達(dá)病毒的戊四氮點(diǎn)燃癲癇大鼠模型后,再次給予顱內(nèi)DG區(qū)定位注射生物素標(biāo)記地葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)進(jìn)行順性軸突示蹤,觀察海馬苔蘚樣纖維生長投射受不同水平Sema7A的影響。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染干預(yù)和過表達(dá)慢病毒載體后,通過免疫熒光結(jié)果可見慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染了大鼠海馬DG區(qū)的神經(jīng)元細(xì)胞;免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,注射Sema7A-RNAi抑制慢病毒載體后14天和42天,Sema7A的表達(dá)水平與Con-RNAi對(duì)照組相比明顯下降,注射Sema7A過表達(dá)慢病毒載體后14天和42天,Sema7A的表達(dá)水平與Con-Sema7A對(duì)照組相比明顯增高(p0.05)。2.在戊四氮慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠模型中,下調(diào)Sema7A的表達(dá)水平可以使第一次4或5級(jí)癲癇發(fā)作的潛伏期明顯延長,使4和5級(jí)癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時(shí)間明顯減少,4和5級(jí)癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)明顯減少;而過表達(dá)Sema7A可以使第一次4或5級(jí)癲癇發(fā)作的潛伏期明顯縮短,使4和5級(jí)癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時(shí)間明顯延長,4和5級(jí)癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)明顯增多(p0.05)。3.敲低癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達(dá)水平,可以使海馬區(qū)苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)的投射數(shù)量明顯減少;過表達(dá)癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達(dá),可以使海馬區(qū)苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)的異常生長,投射數(shù)量明顯增多,且向外層發(fā)芽(p0.05)。結(jié)論:1.Sema7A-RNAi和Sema7A慢病毒載體均可以成功敲低和過表達(dá)SD大鼠海馬DG區(qū)Sema7A的表達(dá)水平;2.敲低Sema7A水平可以降低大鼠癲癇發(fā)作的易感性,相反過表達(dá)Sema7A水平可以提高大鼠癲癇發(fā)作的易感性,Sema7A可以促進(jìn)癲癇發(fā)作。3.在癲癇大鼠中,Sema7A可以影響苔蘚纖維生長,促進(jìn)苔蘚纖維從門區(qū)向CA3區(qū)異常生長投射并發(fā)芽。第三部分Sema7A在癲癇中的作用機(jī)制目的:過去研究認(rèn)為Sema7A可以通過MAPK通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。因此我們認(rèn)為在癲癇中Sema7A可能也通過MAPK通路來發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)癲癇的易感性。本部分主要探討Sema7A是否通過ERK通路調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬腦組織中的炎癥反應(yīng)及軸突苔蘚纖維生長。方法:1.選取雄性SD成年大鼠,隨機(jī)分組為癲癇干預(yù)對(duì)照組(Con-RNAi)、癲癇干預(yù)組(Sema7A-RNAi)、癲癇過表達(dá)對(duì)照組(Con-Sema7A)、癲癇過表達(dá)組(Sema7A),分別用相應(yīng)慢病毒進(jìn)行大鼠海馬DG區(qū)定位注射。2.使用免疫印跡方法檢測在過表達(dá)和敲低戊四氮癲癇大鼠海馬DG區(qū)的Sema7A表達(dá)水平后,下游通路ERK1/2磷酸化水平,以及下游炎癥因子白介素6(interleukin-6,IL-6),腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)在不同組之間的表達(dá)變化。5.將Sema7A過表達(dá)慢病毒定位注射在大鼠海馬DG區(qū),將過表達(dá)Sema7A組和過表達(dá)對(duì)照組的癲癇大鼠給予每日腹腔注射ERK1/2磷酸化抑制劑U0126(30mg/kg)抑制ERK1/2磷酸化水平,觀察統(tǒng)計(jì)造模過程中癲癇大鼠的行為學(xué)改變,包括出現(xiàn)第一次4或5級(jí)癲癇發(fā)作的潛伏期,4和5級(jí)癲癇發(fā)作的總的持續(xù)時(shí)間,4或5級(jí)癲癇發(fā)作的發(fā)作次數(shù)。6.檢測給予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A過表達(dá)組和過表達(dá)對(duì)照組下游炎癥因子IL-6,TNF-α在不同組之間的表達(dá)變化。7.檢測給予U0126抑制ERK1/2磷酸化水平后,Sema7A過表達(dá)組和過表達(dá)對(duì)照組給予顱內(nèi)DG區(qū)定位注射生物素葡糖聚胺(Biotindextran amine,BDA)進(jìn)行順性軸突示蹤,觀察海馬苔蘚樣纖維生長投射受不同水平Sema7A的影響。結(jié)果:1.在戊四氮慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠模型中,敲低Sema7A可以使ERK1/2的磷酸化水平,而過表達(dá)Sema7A則可以使ERK1/2的磷酸化水平明顯上調(diào)(p0.05)。說明Sema7A的表達(dá)水平和ERK1/2的磷酸化水平正性相關(guān)。2.敲低Sema7A可以使癲癇大鼠海馬腦組織中的炎性因子IL-6,TNF-α水平明顯降低,而過表達(dá)Sema7A則可以使IL-6,TNF-α水平明顯增高(p0.05)。3.給予U0126抑制劑明顯地降低了癲癇大鼠過表達(dá)Sema7A對(duì)ERK1/2磷酸化水平的上調(diào)作用(p0.05)。4.抑制劑U0126明顯抑制了癲癇大鼠過表達(dá)Sema7A對(duì)炎癥因子IL-6和TNF-α的正性上調(diào)作用,使兩種炎性因子的表達(dá)水平較過表達(dá)組明顯降低(p0.05)。5.過表達(dá)Sema7A的癲癇大鼠給予抑制劑U0126后,通過BDA神經(jīng)示蹤發(fā)現(xiàn),該組的苔蘚纖維生長較過表達(dá)組明顯減少,從大鼠海馬門區(qū)向CA3區(qū)投射的苔蘚纖維數(shù)量變少(p0.05)。結(jié)論:1.在癲癇大鼠腦組織中,上調(diào)或下調(diào)Sema7A可以引起ERK1/2磷酸化水平,炎癥因子IL-6,TNF-α的水平改變,提示Sema7A可能通過ERK1/2通路實(shí)現(xiàn)對(duì)癲癇中炎癥反應(yīng)的調(diào)控。2.U0126可以抑制EKR1/2磷酸化水平,抑制Sema7A對(duì)癲癇大鼠行為學(xué)的影響,以及對(duì)IL-6及TNF-α水平的上調(diào)作用。同時(shí)U0126可以抑制Sema7A對(duì)癲癇大鼠海馬苔蘚纖維的生長。提示在癲癇大鼠中,Sema7A影響神經(jīng)炎癥反應(yīng)及苔蘚纖維生長的作用機(jī)制是通過對(duì)ERK磷酸化通路調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.1
【圖文】：

35圖 1-1. Sema7A 在 TLE 患者和對(duì)照組患者中的表達(dá)分析Fig1-1. Sema7A expression in TLE patients and nonepileptic patients.（a）Sema7A 在 TLE 患者和對(duì)照組患者中的免疫熒光代表圖。Sema7A（綠色）和 NSE（紅

圖 1-2. PTZ 點(diǎn)燃模型大鼠的 LFP 驗(yàn)證。Fig1-2. LFP recordings from rats after PTZ kindling.驗(yàn)過程的示意圖。給予點(diǎn)燃大鼠最后一次 PTZ 注射后將電極植入背側(cè)海馬P。（b）來自成功點(diǎn)燃的大鼠代表性的 LFP 腦電記錄圖（基線，發(fā)作間期和期和發(fā)作期均檢測到癲癇波，證明 PTZ 模型成功。ematic diagram of the experimental design. The electrodes were implantedhippocampus after the last PTZ injection, and then the LFP was recontative LFP recording from a successfully kindled rat. The baseline, intericta were recorded. Seizure spikes were detected in both the interictal and ictaeans that the PTZ models are successful.

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本文編號(hào)：2721030