【摘要】：研究背景煙霧病(Moyamoya disease,MMD)是一種進(jìn)行性閉塞性腦血管結(jié)構(gòu)異常的腦血管疾病。其特征是頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段及其近端分支的進(jìn)行性狹窄或閉塞,隨后形成異常的側(cè)支血管。作為兒童卒中和青年卒中的主要原因之一,雖然煙霧病的研究在過(guò)去取得了很大的進(jìn)展,但其病因和發(fā)病機(jī)制仍是未知的。本研究團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了關(guān)于中國(guó)漢族人種煙霧病的2階段全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(Genome-Wide Association Study,GWAS),組織富集分析顯示相關(guān)基因座的基因在免疫系統(tǒng)中高度表達(dá)。這些結(jié)果提示中國(guó)漢族人種煙霧病可能與免疫相關(guān)。眾所周知,人類(lèi)白細(xì)胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)在免疫系統(tǒng)中具有重要的作用,但HLA區(qū)域與中國(guó)漢族人種煙霧病之間的相關(guān)研究目前研究較少。此外,前期研究也在組蛋白去乙�；�9(Histone deacetylase 9,HDAC9)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP),rs2107595,既往研究發(fā)現(xiàn)HDAC9區(qū)域與大血管疾病相關(guān),結(jié)合以上研究結(jié)果,我們假設(shè)中國(guó)漢族人種煙霧病可能與免疫相關(guān),可能與大血管疾病存在一些共同的發(fā)病機(jī)制。研究目的為進(jìn)一步驗(yàn)證假設(shè),擬分別通過(guò)研究一即對(duì)中國(guó)漢族人種煙霧病患者及健康對(duì)照組的HLA區(qū)域進(jìn)行遺傳學(xué)分析,研究二即大血管卒中風(fēng)險(xiǎn)基因HDAC9在煙霧病患者中進(jìn)行驗(yàn)證,為進(jìn)一步的探討中國(guó)漢族人種煙霧病的發(fā)病機(jī)制提供遺傳學(xué)依據(jù)。此外,我們也擬進(jìn)行研究三即利用煙霧病的危險(xiǎn)因素同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)處理原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細(xì)胞,探討HDAC9在腦血管平滑肌中的作用,進(jìn)一步探討HDAC9在煙霧病中可能的作用。研究方法研究一:(1)對(duì)755例煙霧病患者及2031例對(duì)照利用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片進(jìn)行全基因組分型,并提取HLA區(qū)域的基因分型位點(diǎn)。(2)對(duì)所獲取的HLA區(qū)域中數(shù)據(jù)的SNPs、經(jīng)典等位基因和相應(yīng)的氨基酸多態(tài)性利用SNP2HLA基因填補(bǔ)(Imputation)的方法進(jìn)行填充。(3)利用逐步回歸分析的方法,發(fā)現(xiàn)煙霧病在HLA區(qū)域內(nèi)的獨(dú)立信號(hào)并進(jìn)行相關(guān)的分析;研究二:(1)使用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片對(duì)755例煙霧病患者及2031例對(duì)照進(jìn)行全基因組范圍基因分型,整理HDAC9區(qū)域的基因分型位點(diǎn)。(2)將755例煙霧病患者及2031例對(duì)照的HDAC9的基因分型數(shù)據(jù)利用Plink1.07軟件進(jìn)行趨勢(shì)卡方檢驗(yàn),以獲取兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異的等位基因頻率;研究三:(1)利用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察在不同濃度Hcy處理24小時(shí)和48小時(shí)后,腦血管平滑肌細(xì)胞增殖的情況。(2)利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察500μM Hcy處理48小時(shí)對(duì)腦血管平滑肌細(xì)胞的遷移功能的影響。(3)利用RT-PCR和Western-blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)上述處理后腦血管平滑肌細(xì)胞的HDAC9表達(dá)量的變化。(4)構(gòu)建HDAC9 shRNA并處理腦血管平滑肌細(xì)胞,分別用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞HDAC9表達(dá)量的變化。(5)HDAC9 shRNA處理腦血管平滑肌細(xì)胞,利用CCK-8和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察在500μM Hcy處理下細(xì)胞增殖和遷移的變化。研究結(jié)果研究一:通過(guò)SNP2HLA進(jìn)行Imputation,共獲得24862個(gè)SNP,178個(gè)經(jīng)典HLA等位基因及688個(gè)氨基酸位點(diǎn)。其中P值最顯著的SNP為rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79)。關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的經(jīng)典等位基因?yàn)镠LA-B*46(P=4.12×10~(-11),OR=0.49),關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的氨基酸多態(tài)性為HLA-B分子第24位丙氨酸殘基(Ala,A,P=3.48×10~(-14),OR=1.58)。通過(guò)逐步回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)了rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79),rs1071817(P=1.26×10~(-11),OR=0.62)2個(gè)獨(dú)立信號(hào)。將SNP置入eQTL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查詢,發(fā)現(xiàn)rs3129731與HLA-DQA2基因的表達(dá)有關(guān);研究二:通過(guò)從煙霧病的外周血全基因組數(shù)據(jù)中提取7p21內(nèi)HDAC9區(qū)域的GWAS數(shù)據(jù),共獲得了321個(gè)SNP。顯著相關(guān)的SNP有114個(gè)。其中rs2107595(P=1.40×10~(-14),OR=1.69),rs2389995(P=0.03,OR=1.16)在煙霧病病例與對(duì)照間存在顯著性差異;研究三:原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細(xì)胞增殖功能均隨著Hcy處理的濃度增加而增強(qiáng),且處理48小時(shí)后,濃度為500μM Hcy處理的腦血管平滑肌細(xì)胞增殖最顯著;500μM Hcy處理腦血管平滑肌細(xì)胞48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,其的遷移顯著加快且細(xì)胞內(nèi)HDAC9的表達(dá)水平顯著增加;我們構(gòu)建了HDAC9 shRNA用于干擾腦血管平滑肌細(xì)胞HDAC9的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC9 shRNA可以顯著的降低腦血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)HDAC9 mRNA和HDAC9蛋白的表達(dá);500μM Hcy處理48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,HDAC9 shRNA處理組的腦血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力顯著降低。研究結(jié)論本課題首先通過(guò)Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片對(duì)768例煙霧病患者及2041例對(duì)照進(jìn)行全基因組分型,然后對(duì)HLA區(qū)域進(jìn)行Imputation及相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)了2個(gè)中國(guó)漢族人群的HLA區(qū)域的獨(dú)立信號(hào),證明了HLA區(qū)域在煙霧病發(fā)病中的重要作用,說(shuō)明中國(guó)漢族人種煙霧病與免疫相關(guān);然后在HDAC9基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)了既往報(bào)道的與大血管卒中相關(guān)的位點(diǎn),提示煙霧病可能與大血管卒中存在可能的共同的致病機(jī)制,且HDAC9參與其中;最后通過(guò)利用煙霧病的危險(xiǎn)因素同型半胱氨酸處理原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細(xì)胞,研究HDAC9在腦血管平滑肌細(xì)胞中的作用,結(jié)果顯示HDAC9在維持腦血管平滑肌細(xì)胞功能具有重要作用。通過(guò)以上的研究闡釋了在中國(guó)漢族人種煙霧病與免疫相關(guān),此外可能與大血管卒中存在可能的共同的致病機(jī)制,而這一致病機(jī)制中HDAC9可能參與其中。以上結(jié)果闡述了煙霧病的部分發(fā)病機(jī)制,為煙霧病的進(jìn)一步研究提供了新方向和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R743
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文果全基因組 SNP 分型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果由于異常的雜合性＞平均值±3SD 或基因分型檢出率＜98%排除 1 例煙和 3 例健康對(duì)照。然后我們使用 PLINK 1.07 軟件中的 IBD 分析檢查了病組的潛在遺傳相關(guān)性。對(duì)檢測(cè)到的所有同卵雙胞胎、第一、第二相對(duì)樣率較低的 3 例煙霧病病例進(jìn)行剔除。采用主成分分析法（PCA）發(fā)現(xiàn)有病病例和 7 例健康對(duì)照為離群值，這些被剔除。最終共有 755 例煙霧病031 例健康對(duì)照樣本納入研究。結(jié)合 Hap Map 樣本分型數(shù)據(jù)，對(duì) 755 例煙霧病病例和 2031 例健康對(duì)照分利用 PCA 分析方法分析匹配的情況，結(jié)果如圖 1 所示，兩組樣本間基本異常的偏離樣本。此外對(duì)兩組 747089 個(gè)全基因組范圍內(nèi)的常染色體 SN分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組樣本匹配良好（λgc 為 1.04）。

susceptibilityChr Varients A1/A2Frequency of A1P OR（95% CI）Cases ControlHLA allele6 HLA-B*46 P/A 0.07 0.14 4.12×10-110.49（0.40-0.61）Amino acid polymorphism6 HLA-B amino acid Ala 24 A/P 0.57 0.45 3.48×10-141.58（1.41-1.78）SNPs6 rs3129731 T/G 0.26 0.17 3.69×10-161.79（1.554-2.061）Chr 為染色體號(hào)；A1/A2 分別是：A1：最小等位基因， A2：最大等位基因，其中 A/P 中，P 代表存在，A 代表不存在；P 為 logistic 關(guān)聯(lián)分析的 P 值；OR 為優(yōu)勢(shì)比，95% CI 為 95%的置信區(qū)間（Confidence interval, CI）。

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本文編號(hào)：2719912