【摘要】：研究背景煙霧病(Moyamoya disease,MMD)是一種進行性閉塞性腦血管結(jié)構(gòu)異常的腦血管疾病。其特征是頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段及其近端分支的進行性狹窄或閉塞,隨后形成異常的側(cè)支血管。作為兒童卒中和青年卒中的主要原因之一,雖然煙霧病的研究在過去取得了很大的進展,但其病因和發(fā)病機制仍是未知的。本研究團隊前期進行了關(guān)于中國漢族人種煙霧病的2階段全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(Genome-Wide Association Study,GWAS),組織富集分析顯示相關(guān)基因座的基因在免疫系統(tǒng)中高度表達。這些結(jié)果提示中國漢族人種煙霧病可能與免疫相關(guān)。眾所周知,人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)在免疫系統(tǒng)中具有重要的作用,但HLA區(qū)域與中國漢族人種煙霧病之間的相關(guān)研究目前研究較少。此外,前期研究也在組蛋白去乙�；�9(Histone deacetylase 9,HDAC9)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP),rs2107595,既往研究發(fā)現(xiàn)HDAC9區(qū)域與大血管疾病相關(guān),結(jié)合以上研究結(jié)果,我們假設(shè)中國漢族人種煙霧病可能與免疫相關(guān),可能與大血管疾病存在一些共同的發(fā)病機制。研究目的為進一步驗證假設(shè),擬分別通過研究一即對中國漢族人種煙霧病患者及健康對照組的HLA區(qū)域進行遺傳學(xué)分析,研究二即大血管卒中風(fēng)險基因HDAC9在煙霧病患者中進行驗證,為進一步的探討中國漢族人種煙霧病的發(fā)病機制提供遺傳學(xué)依據(jù)。此外,我們也擬進行研究三即利用煙霧病的危險因素同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)處理原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細胞,探討HDAC9在腦血管平滑肌中的作用,進一步探討HDAC9在煙霧病中可能的作用。研究方法研究一:(1)對755例煙霧病患者及2031例對照利用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片進行全基因組分型,并提取HLA區(qū)域的基因分型位點。(2)對所獲取的HLA區(qū)域中數(shù)據(jù)的SNPs、經(jīng)典等位基因和相應(yīng)的氨基酸多態(tài)性利用SNP2HLA基因填補(Imputation)的方法進行填充。(3)利用逐步回歸分析的方法,發(fā)現(xiàn)煙霧病在HLA區(qū)域內(nèi)的獨立信號并進行相關(guān)的分析;研究二:(1)使用Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片對755例煙霧病患者及2031例對照進行全基因組范圍基因分型,整理HDAC9區(qū)域的基因分型位點。(2)將755例煙霧病患者及2031例對照的HDAC9的基因分型數(shù)據(jù)利用Plink1.07軟件進行趨勢卡方檢驗,以獲取兩組之間存在統(tǒng)計學(xué)的差異的等位基因頻率;研究三:(1)利用CCK-8實驗觀察在不同濃度Hcy處理24小時和48小時后,腦血管平滑肌細胞增殖的情況。(2)利用細胞劃痕實驗觀察500μM Hcy處理48小時對腦血管平滑肌細胞的遷移功能的影響。(3)利用RT-PCR和Western-blot的實驗方法檢測上述處理后腦血管平滑肌細胞的HDAC9表達量的變化。(4)構(gòu)建HDAC9 shRNA并處理腦血管平滑肌細胞,分別用RT-PCR和Western Blot檢測細胞HDAC9表達量的變化。(5)HDAC9 shRNA處理腦血管平滑肌細胞,利用CCK-8和細胞劃痕實驗分別觀察在500μM Hcy處理下細胞增殖和遷移的變化。研究結(jié)果研究一:通過SNP2HLA進行Imputation,共獲得24862個SNP,178個經(jīng)典HLA等位基因及688個氨基酸位點。其中P值最顯著的SNP為rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79)。關(guān)聯(lián)最強的經(jīng)典等位基因為HLA-B*46(P=4.12×10~(-11),OR=0.49),關(guān)聯(lián)最強的氨基酸多態(tài)性為HLA-B分子第24位丙氨酸殘基(Ala,A,P=3.48×10~(-14),OR=1.58)。通過逐步回歸分析,我們發(fā)現(xiàn)了rs3129731(P=3.69×10~(-16),OR=1.79),rs1071817(P=1.26×10~(-11),OR=0.62)2個獨立信號。將SNP置入eQTL數(shù)據(jù)庫進行查詢,發(fā)現(xiàn)rs3129731與HLA-DQA2基因的表達有關(guān);研究二:通過從煙霧病的外周血全基因組數(shù)據(jù)中提取7p21內(nèi)HDAC9區(qū)域的GWAS數(shù)據(jù),共獲得了321個SNP。顯著相關(guān)的SNP有114個。其中rs2107595(P=1.40×10~(-14),OR=1.69),rs2389995(P=0.03,OR=1.16)在煙霧病病例與對照間存在顯著性差異;研究三:原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細胞增殖功能均隨著Hcy處理的濃度增加而增強,且處理48小時后,濃度為500μM Hcy處理的腦血管平滑肌細胞增殖最顯著;500μM Hcy處理腦血管平滑肌細胞48小時后,與對照組相比,其的遷移顯著加快且細胞內(nèi)HDAC9的表達水平顯著增加;我們構(gòu)建了HDAC9 shRNA用于干擾腦血管平滑肌細胞HDAC9的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDAC9 shRNA可以顯著的降低腦血管平滑肌細胞內(nèi)HDAC9 mRNA和HDAC9蛋白的表達;500μM Hcy處理48小時后,與對照組相比,HDAC9 shRNA處理組的腦血管平滑肌細胞的增殖和遷移能力顯著降低。研究結(jié)論本課題首先通過Illumina Human Omni Zhong Hua-8芯片對768例煙霧病患者及2041例對照進行全基因組分型,然后對HLA區(qū)域進行Imputation及相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)了2個中國漢族人群的HLA區(qū)域的獨立信號,證明了HLA區(qū)域在煙霧病發(fā)病中的重要作用,說明中國漢族人種煙霧病與免疫相關(guān);然后在HDAC9基因區(qū)域發(fā)現(xiàn)了既往報道的與大血管卒中相關(guān)的位點,提示煙霧病可能與大血管卒中存在可能的共同的致病機制,且HDAC9參與其中;最后通過利用煙霧病的危險因素同型半胱氨酸處理原代培養(yǎng)腦血管平滑肌細胞,研究HDAC9在腦血管平滑肌細胞中的作用,結(jié)果顯示HDAC9在維持腦血管平滑肌細胞功能具有重要作用。通過以上的研究闡釋了在中國漢族人種煙霧病與免疫相關(guān),此外可能與大血管卒中存在可能的共同的致病機制,而這一致病機制中HDAC9可能參與其中。以上結(jié)果闡述了煙霧病的部分發(fā)病機制,為煙霧病的進一步研究提供了新方向和理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文果全基因組 SNP 分型數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果由于異常的雜合性＞平均值±3SD 或基因分型檢出率＜98%排除 1 例煙和 3 例健康對照。然后我們使用 PLINK 1.07 軟件中的 IBD 分析檢查了病組的潛在遺傳相關(guān)性。對檢測到的所有同卵雙胞胎、第一、第二相對樣率較低的 3 例煙霧病病例進行剔除。采用主成分分析法（PCA）發(fā)現(xiàn)有病病例和 7 例健康對照為離群值，這些被剔除。最終共有 755 例煙霧病031 例健康對照樣本納入研究。結(jié)合 Hap Map 樣本分型數(shù)據(jù)，對 755 例煙霧病病例和 2031 例健康對照分利用 PCA 分析方法分析匹配的情況，結(jié)果如圖 1 所示，兩組樣本間基本異常的偏離樣本。此外對兩組 747089 個全基因組范圍內(nèi)的常染色體 SN分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組樣本匹配良好（λgc 為 1.04）。

susceptibilityChr Varients A1/A2Frequency of A1P OR（95% CI）Cases ControlHLA allele6 HLA-B*46 P/A 0.07 0.14 4.12×10-110.49（0.40-0.61）Amino acid polymorphism6 HLA-B amino acid Ala 24 A/P 0.57 0.45 3.48×10-141.58（1.41-1.78）SNPs6 rs3129731 T/G 0.26 0.17 3.69×10-161.79（1.554-2.061）Chr 為染色體號；A1/A2 分別是：A1：最小等位基因， A2：最大等位基因，其中 A/P 中，P 代表存在，A 代表不存在；P 為 logistic 關(guān)聯(lián)分析的 P 值；OR 為優(yōu)勢比，95% CI 為 95%的置信區(qū)間（Confidence interval, CI）。

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