【摘要】：研究背景新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是造成新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因之一。HIBD后神經(jīng)系統(tǒng)受損最為嚴重,往往遺留諸多后遺癥,如腦性癱瘓、智力低下及癲癇等。對孩子、家庭和社會產(chǎn)生了巨大的影響。另一方面,伴隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展,HIBD的病死率逐年下降,但致殘率卻呈上升趨勢。因此,早期、有效的治療HIBD,對于降低患兒殘障率,提高人口素質(zhì),有著至關(guān)重要的作用。目前,對于HIBD的臨床治療僅局限于在一定程度上緩解癥狀,其神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率仍居高不下,因此,深入探討HIBD后的神經(jīng)元損傷/保護機制,為治療HIBD尋找新的突破口具有重要的意義。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-l alpha,HIF-1 α)是低氧環(huán)境下細胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。正常生理條件下,細胞內(nèi)不斷合成的HIF-1 α可通過泛素-蛋白酶途徑降解。當細胞受到低氧刺激時,HIF-]α的降解受到抑制,在胞內(nèi)大量聚集,通過調(diào)控其靶基因的表達從而維持細胞的能量代謝。自噬是一種廣泛存在于真核細胞中特有的生命現(xiàn)象,其本質(zhì)是細胞內(nèi)利用溶酶體對自身受損的細胞器或者生物大分子物質(zhì)進行降解和再利用的過程。在饑餓狀態(tài)下,自噬可分解胞內(nèi)沒用的細胞器,從而為細胞生存提供氨基酸和小分子物質(zhì),維持正常的細胞代謝。所以自噬是細胞維持正常代謝平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的重要途徑。近年來研究表明,自噬能夠維持細胞本身的新陳代謝,除此之外,自噬在人體許多其他疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,如癌癥等。自噬從酵母到哺乳動物在進化上表現(xiàn)高度保守性。Beclin 1是酵母自噬相關(guān)基因在哺乳動物中的同源基因,是自噬的直接執(zhí)行者,參與自噬泡的形成,其表達量越高說明細胞的自噬活性越強。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)位于自噬泡的膜表面。自噬泡形成的數(shù)量與LC3的含量呈正比。因此,Beclin 1和LC3的表達量可以用來衡量細胞自噬的程度。近年來研究認為,低氧誘導(dǎo)的自噬與HIF-1 α的異常表達有關(guān)。低氧環(huán)境中,細胞中聚集的HIF-1α能促進BCL2/腺病毒E1B相關(guān)蛋白3(BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3,BNIP3)的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。而BNIP3可以與Beclin 1競爭結(jié)合bcl-2,造成大量游離的Beclin 1,從而激活細胞自噬。因此,上調(diào)的HIF-1a可通過加強其靶基因BNIP3的表達,激活自噬。目前國內(nèi)外主要是在腫瘤細胞中進行HIF-1 α與自噬關(guān)系的研究,而HIBD時神經(jīng)元的自噬是否也存在相同的作用機制需要進一步研究。本研究擬通過體內(nèi)外實驗闡明缺氧缺血中自噬對腦損傷的影響,以及HIF-1α對神經(jīng)元自噬的調(diào)節(jié)機制,為HIBD的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。目的1.探索氧糖剝奪后皮層神經(jīng)元細胞中的自噬程度,及其對細胞生存率和死亡率的影響。2.探討氧糖剝奪后皮層神經(jīng)元細胞中HIF-1α的表達狀況,并分析皮層神經(jīng)元細胞中HIF-1 α的表達與自噬的相關(guān)性。3.細胞實驗驗證氧糖剝奪后,HIF-1α是否通過HIF-1α/BNIP3/Beclinl信號通路調(diào)控皮層神經(jīng)元細胞的自噬。4.動物實驗探索自噬在缺氧缺血性腦損傷中的作用及相關(guān)機制,為臨床治療提供新的途徑。方法1.分離培養(yǎng)新生24 h內(nèi)的SD大鼠皮層神經(jīng)元,皮層神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱中進行,溫度控制在37℃,體積分數(shù)為5%CO2、濕度控制在飽和狀態(tài)。采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶對神經(jīng)元進行鑒定。2.選取體外培養(yǎng)5d的神經(jīng)元細胞,使用氧糖剝奪法,制作細胞缺氧模型。具體操作如下:替換培養(yǎng)基,使用預(yù)先以無氧混合氣體填充30min的無糖DMEM培養(yǎng)液,隨后將細胞置于無氧混合氣體填充的容器中,37℃,飽和濕度條件下培養(yǎng) 1.5h。在氧糖剝奪后 Oh、6h、12h、24h 和 48h,用 Annexin V-FITC/PI雙染色法測定神經(jīng)元細胞凋亡率,MTT法測定神經(jīng)元存活率,Western blot法測定皮層神經(jīng)元的HIF-1α、BNIP3、自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin 1表達量。在氧糖剝奪后Oh、12h,MDC熒光染色、激光共聚焦顯微鏡、透射電子顯微鏡觀察細胞自噬的變化。3.分別用HIF-1α的抑制劑ME2、自噬抑制劑3-MA、自噬促進劑Rapa預(yù)處理皮層神經(jīng)元細胞 30 min,HIF-Iα siRNA、BNIP3 siRNA、Beclin 1 siRNA轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元細胞,氧糖剝奪Oh、12h后Annexin V-FITC/PI雙染色法測定神經(jīng)元細胞凋亡率,MTT法測定神經(jīng)元存活率,Western blot法測定皮層神經(jīng)元細胞BNIP3、Beclin 1、HIF-1α、自噬蛋白LC3表達量。4.將60只7日齡的SD大鼠按窩別、體重配對后隨機分為2組(Sham組、HIBD組),每組30只。每組分別于造模后6h、12h、24h、48h、72h處死,qRT-PCR、Western blot 檢測 HIF-1 α mRNA、BNIP3 mRNA、Beclin 1 mRNA 及其蛋白水平的表達變化。5.將54只7日齡的SD大鼠按窩別、體重配對后隨機分為3組(Sham組,HIBD 組,HIBD+3-MA 組),依據(jù)實驗一的 qRT-PCR、Western blot 結(jié)果,三組均在造模后24h處死取腦,免疫熒光雙標染色進行細胞定位、Western blot檢測自噬蛋白LC3表達變化、干濕重法測量腦水腫、TUNEL熒光染色檢測凋亡率。結(jié)果1.原代皮層神經(jīng)元大多數(shù)在數(shù)小時內(nèi)開始貼壁,呈圓形或橢圓型,體積小,立體感強。培養(yǎng)第2天,幾乎所有細胞會長出一個突起,胞體增大,呈圓形或橢圓形,光暈明顯。培養(yǎng)第3天細胞繼續(xù)增大,突起延長。培養(yǎng)第5天時神經(jīng)元胞體明顯增大,呈圓形、橢圓或者錐體形,細胞以雙極型、三極型多見,偶見單極型。2.在體外氧糖剝奪模型中,隨著時間延長,皮層神經(jīng)元細胞死亡率逐漸增加,存活率逐漸下降;且HIF-1α表達量逐漸增加,抑制HIF-1α表達,可以降低皮層神經(jīng)元細胞的死亡,提高細胞的存活率。3.在體外氧糖剝奪模型中,隨著時間逐漸增加,LC3的表達量逐漸增加。氧糖剝奪12h時,激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞內(nèi)出現(xiàn)大量綠色亮點,透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)有大量的雙層囊泡形成,并且MDC標記細胞陽性細胞率明顯增加。4.氧糖剝奪模型下,自噬抑制劑3-MA可以提高皮層神經(jīng)元細胞存活率。在自噬促進劑Rapa作用下,皮層神經(jīng)元細胞存活率顯著降低。5.氧糖剝奪模型下,阻斷Beclin1的表達可增加皮層神經(jīng)元細胞存活率,降低死亡率。6.體內(nèi)大鼠HIBD模型中,缺血區(qū)皮層神經(jīng)元細胞的自噬及凋亡增加,腦組織水腫明顯。自噬抑制劑3-MA能減輕缺血區(qū)神經(jīng)元的自噬及凋亡,改善腦組織水腫。結(jié)論1.腦缺氧缺血環(huán)境誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元細胞自噬途徑啟動,導(dǎo)致皮層神經(jīng)元細胞死亡。2.氧糖剝奪后,皮層神經(jīng)元細胞中HIF-1α表達上調(diào),并可能通過HIF-1α/BNIP3/Beclin1信號通路啟動自噬途徑,導(dǎo)致了細胞死亡效應(yīng),并進一步加重了神經(jīng)功能損傷。3.干擾自噬途徑,可以抑制皮層神經(jīng)元細胞的死亡效應(yīng),為HIBD的治療提供了新的靶點。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.3
【圖文】：

在倒置顯微鏡下對原代皮層神經(jīng)元細胞在體外培養(yǎng)條件下的形態(tài)學(xué)特征進逡逑行觀察。在離體后的數(shù)小時內(nèi)，大多數(shù)神經(jīng)元開始貼壁，形態(tài)為為圓形或橢圓逡逑型，體積小，立體感強。見圖１．１。體外培養(yǎng)４８ｈ后，細胞會形成一個突起，胞逡逑體明顯增大，細胞呈圓形或橢圓形，光暈明顯（圖１．２）。隨著體外培養(yǎng)時間延逡逑長，細胞繼續(xù)增大，突起延長。見圖１．３邋（體外培養(yǎng)７２ｈ）。體外培養(yǎng)至第５天逡逑時神經(jīng)元胞體明顯增大，呈圓形、橢圓或者錐體形，細胞以雙極型、三極型多逡逑見，偶見單極型。細胞突起變粗變長且有分支，邊緣清晰l柧繅丫�。辶x洗聳鄙窬赴陌邇邐髁�，有灭嬦j黃穡褐氏赴虺殺餛階矗廾麇義舷怨嬖頡＜跡保礎(chǔ)？汕稚窬頭巧窬�。辶x希義賢跡保備戰(zhàn)又值鈉げ閔窬ǎ矗埃逋跡保才嘌矗福璧鈉げ閔窬ǎ矗埃╁義希浮義賢鉀撐嘌罰玻璧鈉げ閔窬ǎ矗埃╁逋跡保磁嘌冢

本文編號：2717635