【摘要】：背景原發(fā)性家族性腦鈣化(Primary Familial Brain Calcification,PFBC),又稱為特發(fā)性基底節(jié)區(qū)鈣化(Idiopathic Basal Ganglia Calcification,IBGC)、Fahr病,是一種罕見的神經(jīng)遺傳退行性疾病,臨床表現(xiàn)多樣,主要有肌張力障礙、頭痛、癡呆、抑郁等。影像學(xué)表現(xiàn)以廣泛的腦內(nèi)多發(fā)對(duì)稱性鈣化為主要特征,多位于雙側(cè)尾狀核、豆?fàn)詈�、丘腦、腦干及小腦齒狀核等部位,但受累個(gè)體血清鈣磷水平、甲狀腺功能、甲狀旁腺功能均正常,這是PFBC區(qū)別于其他腦鈣化疾病的主要鑒別點(diǎn)。目前已知多個(gè)基因突變可導(dǎo)致該疾病發(fā)生和發(fā)展,有:SLC20A2、PDGFB、PDGFRB和XPR1等。位于8號(hào)染色體上的SLC20A2是該病的主要致病基因,已發(fā)現(xiàn)該基因多個(gè)位點(diǎn)突變可導(dǎo)致PFBC發(fā)生。PFBC的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,多與鈣磷代謝失衡相關(guān)。既往的研究表明在生理?xiàng)l件下,腦實(shí)質(zhì)中的無機(jī)磷酸鹽(Inorganic Phosphate,Pi)被無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體2(Inorganic Phosphate Transporter 2,Pi T-2)攝取進(jìn)入腦細(xì)胞內(nèi),Pi通過異嗜性和多嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒受體1(Xenotropic and Polytropic Retrovirus Receptor1,XPR1)從腦細(xì)胞內(nèi)排出。在病理?xiàng)l件下,SLC20A2基因發(fā)生突變,導(dǎo)致其表達(dá)的Pi T-2結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,向胞內(nèi)攝取Pi的能力減弱,Pi在腦實(shí)質(zhì)積聚,胞內(nèi)低磷,進(jìn)而導(dǎo)致鈣沉積。線粒體和高爾基體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,同時(shí)對(duì)鈣磷變化較為敏感。已有研究表明,線粒體和高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的異常參與了阿茲海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson’s Disease,PD)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(Spinalcerebellar Ataxia,SCA)、肌萎縮脊髓側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程,異常線粒體和高爾基體可能是神經(jīng)退行性疾病早期的病理表現(xiàn)。而在PFBC發(fā)病過程中線粒體和高爾基體的變化鮮有報(bào)道。目前,PFBC患者來源的神經(jīng)元不易獲得,對(duì)該病的研究缺乏可靠的細(xì)胞模型,而近年來發(fā)展迅猛的體細(xì)胞重編程為干細(xì)胞技術(shù),為獲得患者來源的疾病細(xì)胞模型提供了新的方向。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cell,i PSC)是與胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cell,ESC)具有相似形態(tài)和生物功能的一類細(xì)胞,在2006年,日本科學(xué)家山中伸彌通過攜帶重編程因子基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞的方法,首次成功誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程為i PS細(xì)胞。并對(duì)其形態(tài)和功能進(jìn)行觀察和檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與胚胎干細(xì)胞形態(tài)類似,并且i PS細(xì)胞在體外也可進(jìn)一步分化為各類體細(xì)胞,為探究疾病的發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞移植和藥物篩選提供理想而可靠的細(xì)胞模型。本研究通過搜集一例PFBC患者所在家系,應(yīng)用Sanger測(cè)序技術(shù)確定其攜帶的致病基因,獲取患者來源的體細(xì)胞,重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,進(jìn)而分化為神經(jīng)前體細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,并對(duì)不同種類細(xì)胞凋亡水平及線粒體和高爾基體的形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)與分析,發(fā)現(xiàn)了PFBC致病基因新的位點(diǎn)突變,成功地構(gòu)建了健康志愿者和PFBC患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系、神經(jīng)前體細(xì)胞系、多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,并初步探討了PFBC的發(fā)病機(jī)制,為后續(xù)進(jìn)一步探討該病的發(fā)病機(jī)制和潛在治療措施等奠定了基礎(chǔ)。目的明確所收集家系所攜帶的致病基因,構(gòu)建健康志愿者和患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞,并初步探討了原發(fā)性家族性腦鈣化的發(fā)病機(jī)制。方法1.利用Sanger測(cè)序技術(shù)確定該原發(fā)性家族性腦鈣化家系的致病基因;2.運(yùn)用重編程技術(shù)構(gòu)建健康志愿者和PFBC患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;3.體外定向分化健康志愿者和PFBC患者疾病特異性i PSCs為神經(jīng)前體細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞;4.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)技術(shù),初步探究SLC20A2基因突變?cè)赑FBC發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果1.Sanger測(cè)序結(jié)果顯示該家系攜帶一個(gè)PFBC已知相關(guān)基因SLC20A2新發(fā)位點(diǎn)突變(c.613GA,p.Val205Met);2.成功獲得健康志愿者和患者來源體細(xì)胞,并成功構(gòu)建野生型和患者特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系;3.健康志愿者和PFBC患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i PSCs)具有胚胎干細(xì)胞樣形態(tài),高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Nanog、SOX2和TRA-1-60,具有正常的二倍體核型,在NOD-SCID小鼠體內(nèi)能成功的分化為具有三胚層的畸胎瘤,患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(i PSCs)仍攜帶致病的SLC20A2基因;4.成功定向誘導(dǎo)i PS細(xì)胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞,進(jìn)一步分化為多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞,免疫熒光染色顯示其分別表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志蛋白(TH和Beta-Tubulin III)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白(GFAP);5.在對(duì)線粒體和高爾基體形態(tài)的檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在線粒體和高爾基體形態(tài)和結(jié)構(gòu)破壞;6.PFBC患者來源的神經(jīng)前體細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡水平高于健康志愿者來源的同類細(xì)胞。結(jié)論1.SLC20A2基因新發(fā)位點(diǎn)突變c.613GA突變可能導(dǎo)致原發(fā)性家族性腦鈣化。2.患者來源組神經(jīng)細(xì)胞線粒體和高爾基體形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常,可能參與PFBC的發(fā)病。3.SLC20A2基因c.613GA突變導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平增高,可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742
【圖文】：

功收集先證者的臨床資料者，男，13 歲，慢性病程，5 年前發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)多發(fā)鈣化，現(xiàn)以年”為主訴入院，主要表現(xiàn)為重復(fù)性動(dòng)作，自言自語，伴有續(xù)數(shù)十秒至 2 分鐘緩解，無大小便失禁、明顯肢體抽搐等正常范圍內(nèi)，甲狀旁腺素輕微升高（66.4pg/mL>65 pg/mL)：顱內(nèi)多發(fā)鈣化，雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、雙側(cè)丘腦、齒狀核異常搐史，其父腦內(nèi)存在多發(fā)鈣化灶（詳見圖 1）。

3.2 Sanger 測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者及其父親攜帶 SLC20A2 基因新發(fā)位點(diǎn)突變（c.613G>A）運(yùn)用 Sanger 測(cè)序的方法篩選該家系是否攜帶目前已知的 PFBC 相關(guān)基因（SLA20A2,SLA20A1,XPR1,PDGFB,PDGFRB,ISG15)，共篩選出 7 個(gè)兩名患者共同攜帶可疑致病變異，包括一個(gè) SLC20A2 基因的雜合子突變(c.613G>A,p.Val205Met)。由于 SLC20A2 基因 c.613G>A 突變是一個(gè)錯(cuò)義突變，可能會(huì)改變SLC20A2 蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，我們推測(cè)該突變最為可能是該家系的致病突變，進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（詳見圖 2）。

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本文編號(hào)：2717214