【摘要】：目的:在腦原位和轉(zhuǎn)移性腫瘤中,腫瘤微環(huán)境是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因素。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞以及其他不同類型的非腫瘤細(xì)胞,主要有星型膠質(zhì)細(xì)胞、周皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞主要包括腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)、小膠質(zhì)細(xì)胞、骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)和T細(xì)胞等,這些免疫細(xì)胞在特定條件下可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境的形成,進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。CD30L屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成員,主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞,還可以表達(dá)在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的表面。CD30L可以促進(jìn)霍奇金淋巴瘤的生長(zhǎng)和增殖,同時(shí)作為免疫調(diào)節(jié)分子,參與多種自身免性疫疾病的病變形成,并發(fā)揮重要作用。以往有關(guān)CD30L與腫瘤的相關(guān)研究多局限在淋巴系或血液來(lái)源腫瘤范疇,而對(duì)于腦膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的形成,以及膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究目前尚屬空白。因此,本課題利用Cd30l基因敲除小鼠(CD30LKO),顱內(nèi)接種鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系-GL261建立膠質(zhì)瘤模型,初步探討Cd30l基因缺失對(duì)小鼠膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的形成及腫瘤進(jìn)展的影響,為今后進(jìn)一步深入研究CD30L在實(shí)體臟器腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。研究方法:1、利用C57BL/6(wild-type,WT)、CD30LKO小鼠和尾靜脈回輸m CD30-Ig抗體的WT小鼠,顱內(nèi)接種GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞系建立小鼠膠質(zhì)瘤模型,觀察其生存率。2、通過(guò)免疫印跡的方法,檢測(cè)正常WT小鼠腦組織、種瘤21天后WT小鼠癌旁組織和腫瘤組織內(nèi)CD30L蛋白水平的改變;通過(guò)免疫熒光的方法,檢測(cè)GL261細(xì)胞表面CD30L的表達(dá);通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT小鼠種瘤21天后,腫瘤浸潤(rùn)的TAM表面CD30L的表達(dá)。3、通過(guò)HE染色,觀察種瘤21天后WT、CD30LKO和尾靜脈回輸m CD30-Ig抗體的WT小鼠腦組織病理改變,并且估算其膠質(zhì)瘤的體積。4、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),比較種瘤21天后WT和CD30LKO小鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞、TAM和MDSC細(xì)胞亞群、細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞功能性分子的變化。5、通過(guò)流式細(xì)胞術(shù),比較種瘤21天后WT和CD30LKO小鼠膠質(zhì)瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的表型和功能的變化。研究結(jié)果:1、在小鼠膠質(zhì)瘤模型中,與WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻斷后,引起小鼠生存率下降。2、在小鼠膠質(zhì)瘤模型中,與正常小鼠腦組織相比,膠質(zhì)瘤腫瘤組織和癌旁組織中CD30L的表達(dá)量明顯升高;GL261細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)的TAM中表達(dá)CD30L。3、種瘤21天后,與WT小鼠相比,Cd30l基因缺失或CD30L分子阻斷后,引起小鼠腫瘤體積增大。4、種瘤21天后,與WT小鼠相比,CD30LKO小鼠腫瘤浸潤(rùn)的小膠質(zhì)細(xì)胞、TAM、CD45+CD11b-的細(xì)胞比例和數(shù)量增加;CD30LKO小鼠腫瘤浸潤(rùn)的TAM和MDSC亞群的細(xì)胞比例和數(shù)量增加;CD30LKO小鼠腫瘤內(nèi)TAM和小膠質(zhì)細(xì)胞的表型更加促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。5、種瘤21天后,與WT小鼠相比,CD30LKO小鼠腫瘤浸潤(rùn)的CD8+PD-1+T細(xì)胞數(shù)量和比例明顯升高,CD8+T細(xì)胞的增殖能力減弱,同時(shí)CD8+T細(xì)胞分泌的效應(yīng)性細(xì)胞因子IFN-g和TNF-a的能力減弱,說(shuō)明CD30L的缺乏引起CD8+T細(xì)胞的耗竭。結(jié)論:CD30L信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、比例數(shù)量以及表型特征,在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,發(fā)揮重要的保護(hù)性作用。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文圖 1. CD30LKO 小鼠促進(jìn)膠質(zhì)瘤的(A)通過(guò)免疫熒光檢測(cè) GL261 小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系上 CD30CD30LKO 顱內(nèi)接種 5×105GL261-EGFP 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。通過(guò)流瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上 CD30L 的表達(dá)情況。(C)通過(guò) WesternBlot 檢瘤21天后癌旁組織(P) 和腫瘤組織(T)中的表達(dá)情況。并且通過(guò)灰(D) 向 WT、CD30LKO 和尾靜脈回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT 小膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。觀察各組種瘤后的生存率 (****,P<0.0001).(E)計(jì)和尾靜脈回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT 小鼠腫瘤體積(***,P<0.001天后 WT 小鼠、CD30LKO 小鼠以及回輸 mCD30-Ig 抗體的 WT分別為 50μm、2000μm 和 1000μm。

15圖 3. CD30L 的缺乏促進(jìn)膠質(zhì)瘤內(nèi)部免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)(A) 在種瘤 21 天后，從 WT 和 CD30LKO 小鼠腦組織中提取浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，計(jì)算浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量。(B) 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) WT 和 CD30LKO 小鼠膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)的的免疫細(xì)胞的亞群，，圈出 EGFP-的細(xì)胞，進(jìn)一步分析 TAM（CD45hiCD11b+）、小膠質(zhì)細(xì)胞（CD45lowCD11b+）和 CD45+CD11b-細(xì)胞的比例和數(shù)量。數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=5）。*,P<0.05;**, P<0.01; ***, P<0.001.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2711434