治療視神經(jīng)脊髓炎全人源抗C5單鏈抗體的研究
【圖文】:
32圖 1.經(jīng)過五輪的噬菌體篩選得到能與補體 C5 結合的噬菌體抗體。將用 0.1 M pH9.6 碳酸鈉碳酸氫鈉溶液稀釋補體 C5(母液為 1mg/mL)后包被 ELISA 孔板,每輪包被的抗原量為 800 ng、600 ng、500 ng、 400 ng、300 ng,包被體系每孔 50~100μl,4°C 過夜;隨著篩選輪數(shù)的增加,包被抗原的量逐漸較少,通過 ELISA 實驗檢測得到的五輪的噬菌體抗體庫與目的蛋白補體 C5 的結合情況,在篩選進行至第五輪時,挑選部分噬菌體克隆檢測與補體C5 的結合情況。(A)隨著篩選的進行 PCR 結果顯示陽性克隆逐漸增多;(B)ELISA 結果顯示隨著篩選的進行噬菌體抗體庫與補體 C5 的在 A450 nm 的數(shù)值逐漸增加,結合力逐漸增強,在篩選進行至第 4 輪和第 5 輪時變化相對平緩;(C)在第 5 輪時,挑選 239 個單個噬菌體克隆進行 ELISA 實驗,不同的噬菌體克隆與補體 C5 結合是不同的。2.2 構建同源性較高的抗體序列至原核表達載體通過噬菌體抗體 ELISA 和測序得到 8 個單鏈抗體,,根據(jù) ELISA 鑒定結果選
天津醫(yī)科大學博士學位論文擇親和能力較強和同源序列較高 C5B3、C5A6 和 B5B35 進行可溶性單鏈抗體的原核表達。將 C5B3 單鏈抗體基因構建至原核表達載體 pET28a、PGEX-4T、pET30a 內(nèi),挑取單個克隆做菌落 PCR,單鏈抗體的核酸序列約 750 bp,陽性率為 100%,結果如圖 2A,初步判斷 C5B3 基因構建至原核表達載體內(nèi),為進一步確認載體構建成功挑選部分陽性克隆測序,測序結果進行序列分析,序列分析主要是通過 DNAMAN 比對測序所得的片段和 C5B3 基因片段是否完全一致,和C5B3 目的基因插入的位置是否正確;以 pET-30a 為例進行說明,圖 2B 為pET30a-C5B3 構建載體的模式圖。
【學位授予單位】:天津醫(yī)科大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2019
【分類號】:R744.52
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本文編號:2706650
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