發(fā)布時間：2020-06-10 18:02

【摘要】：研究目的:視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)自身反應性炎性脫髓鞘疾病,主要累及脊髓和視神經(jīng),還可累及腦實質(zhì)。研究表明NMO的主要病理特征為水通道蛋白-4(Aquaporin 4,AQP4)自身抗體(AQP4-immunoglobulin G,AQP4-IgG)結合星形膠質(zhì)細胞表面的AQP4后,激活補體,導致一系列炎癥反應,造成星形膠質(zhì)細胞丟失、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞受損和神經(jīng)元死亡。目前NMO的治療方式主要是免疫調(diào)節(jié)及血漿置換,但患者仍有較高的死亡率或嚴重的后遺癥。單克隆抗體用于治療NMO正受到越來越多的關注,例如,利妥昔單抗(Rituximab)、依庫珠單抗(Eculizumab)和托珠單抗(Tocilizumab)等單克隆抗體藥物已經(jīng)進入臨床試驗階段,部分抗體藥物已經(jīng)展現(xiàn)出較好的臨床效果。但是,當前開展臨床試驗的該類藥物多數(shù)為鼠源的單克隆抗體,長期應用有引起患者的人抗鼠免疫原性反應(Human anti-mouse anti-antibody,HAMA)的潛在風險。本研究的目的是通過體外噬菌體展示技術從全人源單鏈抗體庫中篩選出能夠特異性結合補體C5(Complement C5,C5)的單鏈抗體(Single-chain variable fragment,scFv),并明確其對NMO疾病模型的治療效果。研究方法:本研究利用噬菌體展示體外固相篩選技術從噬菌體抗體庫(6×10~(10))中篩選能夠特異性結合C5的單鏈抗體。經(jīng)過5輪的篩選(吸附-洗脫-擴增),隨機挑選了239個噬菌體克隆,通過酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)驗證其與補體C5的結合能力和結合特異性。根據(jù)ELISA多次重復的實驗結果,選擇在A450 nm數(shù)值較高的部分克隆進行核酸序列測定,使用DNAMAN進行序列多樣性分析和序列比對,確定重復序列較高的陽性克隆。將重復序列最高的3個基因插入到原核表達載體pET30a(帶有his標簽)中。在低溫(16°C)條件下培養(yǎng),使用異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,簡稱IPTG)誘導單鏈抗體基因在大腸桿菌BL21中可溶性表達。離心收集菌體后進行蛋白純化,經(jīng)過親和層析、DEAE層析、Butyl層析一系列的純化得到純度在90%以上的可溶性單鏈抗體;用超濾管濃縮蛋白濃度至40 mg/mL用于后續(xù)實驗;通過SDS-PAGE變性膠觀察蛋白的片段大小,應用Western Blot、ELISA法鑒定可溶性單鏈抗體與補體C5結合的特異性;進一步用Biacore T200進行單鏈抗體與C5結合的親和力和濃度依賴情況的檢測,從而確定單鏈抗體的親和力與補體C5的結合情況。挑選特異性較好的單鏈抗體作用于NMO體外和動物實驗模型以明確目標單鏈抗體對NMO的治療效果:利用AQP4-IgG和人補體(human complement,hC)作用于穩(wěn)定表達AQP4的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamsters ovary,CHO)模擬NMO的體外實驗模型,通過LIVE/DEAD染色的方法驗證篩選得到的單鏈抗體對NMO細胞模型細胞毒性的影響;選擇腦實質(zhì)注射NMOSD血清陽性患者的抗體(IgG_(NMOSD))和人補體在體內(nèi)模擬視神經(jīng)脊髓炎的發(fā)病情況,通過相關組織染色確定病灶及炎癥細胞的變化,并進一步明確篩選得到的單鏈抗體對NMO的保護效果。結果:1.經(jīng)過5輪噬菌體篩選得到了8個抗體序列(C5B3、C5B35、C5B98、C5B106、C5A6、C5A102、C5A121、C5A152)。將同源性最高的3個序列原核表達后進行一系列純化,獲得了純度在90%以上的可溶性單鏈抗體。2.對純化后的可溶性單鏈抗體(C5B3、C5A6、C5B35)進行了體外功能驗證。結果表明,C5B3明顯減少了穩(wěn)定表達AQP4的CHO細胞的補體依賴性的細胞毒性作用,明顯減少了膜攻擊復合物的形成及死亡細胞的數(shù)量,且該作用具有明顯的C5B3濃度依賴性。3.對單鏈抗體C5B3進行了體內(nèi)功能驗證。在NMO動物模型中,C5B3明顯減小了腦實質(zhì)注射IgG_(NMOSD)和人補體引起的病灶體積和炎癥細胞的浸潤,并且能夠減少體內(nèi)膜攻擊復合物的形成。結論:通過對全人源性噬菌體抗體庫的篩選獲得了特異性結合補體C5的單鏈抗體,經(jīng)過體外及體內(nèi)實驗證實得到的1個單鏈抗體(C5B3)能夠減少AQP4-IgG和人補體造成的細胞毒性,對NMO動物模型也能發(fā)揮一定的保護作用。
【圖文】：

32圖 1.經(jīng)過五輪的噬菌體篩選得到能與補體 C5 結合的噬菌體抗體。將用 0.1 M pH9.6 碳酸鈉碳酸氫鈉溶液稀釋補體 C5（母液為 1mg/mL）后包被 ELISA 孔板，每輪包被的抗原量為 800 ng、600 ng、500 ng、 400 ng、300 ng，包被體系每孔 50～100μl，4°C 過夜；隨著篩選輪數(shù)的增加，包被抗原的量逐漸較少，通過 ELISA 實驗檢測得到的五輪的噬菌體抗體庫與目的蛋白補體 C5 的結合情況，在篩選進行至第五輪時，挑選部分噬菌體克隆檢測與補體C5 的結合情況。（A）隨著篩選的進行 PCR 結果顯示陽性克隆逐漸增多；（B）ELISA 結果顯示隨著篩選的進行噬菌體抗體庫與補體 C5 的在 A450 nm 的數(shù)值逐漸增加，結合力逐漸增強，在篩選進行至第 4 輪和第 5 輪時變化相對平緩；（C）在第 5 輪時，挑選 239 個單個噬菌體克隆進行 ELISA 實驗，不同的噬菌體克隆與補體 C5 結合是不同的。2.2 構建同源性較高的抗體序列至原核表達載體通過噬菌體抗體 ELISA 和測序得到 8 個單鏈抗體，，根據(jù) ELISA 鑒定結果選

天津醫(yī)科大學博士學位論文擇親和能力較強和同源序列較高 C5B3、C5A6 和 B5B35 進行可溶性單鏈抗體的原核表達。將 C5B3 單鏈抗體基因構建至原核表達載體 pET28a、PGEX-4T、pET30a 內(nèi)，挑取單個克隆做菌落 PCR，單鏈抗體的核酸序列約 750 bp，陽性率為 100%，結果如圖 2A，初步判斷 C5B3 基因構建至原核表達載體內(nèi)，為進一步確認載體構建成功挑選部分陽性克隆測序，測序結果進行序列分析，序列分析主要是通過 DNAMAN 比對測序所得的片段和 C5B3 基因片段是否完全一致，和C5B3 目的基因插入的位置是否正確；以 pET-30a 為例進行說明，圖 2B 為pET30a-C5B3 構建載體的模式圖。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R744.52

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本文編號：2706650