【摘要】：本論文主要圍繞朊蛋白(PrP)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變開展相關(guān)工作,探究朊蛋白的細(xì)胞膜定位是否與其構(gòu)象轉(zhuǎn)變有關(guān)。 根據(jù)"Protein-only"學(xué)說(shuō),朊蛋白類疾病是因朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變引起的疾病,目前該學(xué)說(shuō)已經(jīng)基本被證實(shí)。但是,體內(nèi)正常朊蛋白PrPc是如何通過(guò)構(gòu)象轉(zhuǎn)變而成為致命的朊病毒prpSc的,關(guān)于其中的機(jī)理卻知之甚少。根據(jù)前期研究結(jié)果,我們提出如下的朊蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變模型：(1)朊蛋白與細(xì)胞脂膜的相互作用在這個(gè)過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用；(2)細(xì)胞膜的脂筏區(qū)(Raft)存在抑制PrPc發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變的因素,進(jìn)而抑制了其發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變。 為驗(yàn)證上述理論模型,設(shè)計(jì)如下實(shí)驗(yàn)：將正常情況下定位于細(xì)胞膜Raft區(qū)域的PrP分子移到Non-raft區(qū)域,然后檢測(cè)Non-raft區(qū)域定位的PrP分子是否更容易轉(zhuǎn)變成PrPSc。具體是用一段Qa穿膜區(qū)替代PrPc分子中的GPI錨,從而將PrPc分子從Raft區(qū)域移到Non-raft區(qū)域,并在PrP分子的1-230氨基酸殘基和C端的Qa穿膜區(qū)之間插入一段高度靈活、易于彎曲的親水Flag肽段,形成PrP(1-230)-Flag-Qa分子,增加其靈活性。 本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物水平進(jìn)行,建立了PrP(1-230)-3aa-Qa和PrP(1-230)-Flag-Qa兩種轉(zhuǎn)基因鼠,將兩種轉(zhuǎn)基因鼠分別與PrP敲除轉(zhuǎn)基因鼠雜交,使其內(nèi)源PrP敲除。篩選PrP(1-230)-3aa-Qa和PrP(1-230)-Flag-Qa分子可以在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的品系,分別篩選到了有外源PrP(1-230)-3aa-Qa轉(zhuǎn)基因表達(dá)的小鼠品系1株(On15)和有外源PrP(1-230)-Flag-Qa轉(zhuǎn)基因表達(dá)的小鼠品系2株(Flag6和Flag11),并對(duì)其進(jìn)行了腦部朊病毒感染實(shí)驗(yàn),后續(xù)需要觀察轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病情況,記錄病癥潛伏期等。該實(shí)驗(yàn)的順利完成,將有助于回答朊蛋白類疾病發(fā)病機(jī)理的核心問(wèn)題,即朊蛋白是如何從PrPc轉(zhuǎn)變成prpSc的。
【圖文】：

圖1. PrP膜定位示意圖。左側(cè)為體內(nèi)正常表達(dá)的PrP分子，含有GPI描。中間為Pr0)-3aa-Qa分子：用Qa蛋白分子的穿膜丨X:代替野生型PrP分子C端的GP1錨定信號(hào)。2

之后的全部序列。在pMoXho質(zhì)粒的第二外顯子和第三外顯子之間插入moPrP-Qa或moPrP-Flag-Qa 序列，，構(gòu)成 pMoXho-PrPQaonly 或 pMoXho-PrPQaFlag 質(zhì)粒。pMoXho-PrPQaonly 或 pMoXho-PrPQaFlag 質(zhì)粒示意圖如圖 1.1 所示。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706617