【摘要】：目的:神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)以其高發(fā)病率(占惡性腦腫瘤的60%)、高復(fù)發(fā)率(100%)和高死亡率已成為臨床亟待解決的難題。近期,腫瘤治療相關(guān)指南指出:經(jīng)病理確診的臨床膠質(zhì)瘤患者建議予化學(xué)藥物輔助治療。替莫唑胺(TMZ)屬新型口服烷化劑,其可以穿透血腦屏障到達(dá)腫瘤病灶,有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用,延長患者生存時間。然而,臨床上GBM常出現(xiàn)替莫唑胺化療耐藥現(xiàn)象而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā),治療失敗。膠質(zhì)瘤TMZ化療耐藥的分子機(jī)制目前仍未完全闡明。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是這幾年在真核生物中發(fā)現(xiàn)的,并且為一類由19-25個核苷酸組成的非編碼RNA。前期研究表明miRNAs可作為細(xì)胞內(nèi)重要的調(diào)控因子,其在腫瘤細(xì)胞的增殖具有癌基因或抑癌基因的作用,而在早期細(xì)胞的分化或者細(xì)胞的凋亡通路中亦扮演重要的角色。我們前期通過分析膠質(zhì)瘤U251TR耐藥細(xì)胞和U251非耐藥細(xì)胞間miRNA芯片發(fā)現(xiàn):miR-181a-5p在耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平較敏感細(xì)胞株顯著降低。然而,miR-181a-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療耐藥中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制,目前尚未見相關(guān)報道。綜上所述,我們推測miR-181a-5p可能參與了膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥機(jī)制的過程。本課題旨在探討miR-181a-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺耐藥性和侵襲力的調(diào)控作用。通過本課題的研究,闡明并完善臨床膠質(zhì)瘤細(xì)胞TMZ化療耐藥的具體分子機(jī)制;為下一步開展膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的基礎(chǔ)研究提供前期依據(jù),為臨床膠質(zhì)瘤化療耐藥難題提供一種新的治療思路和方案。方法:1.通過qRT-PCR技術(shù),檢測膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞(U251TR)、親本細(xì)胞(U251)、原發(fā)膠質(zhì)瘤組織、化療后復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤組織中miR-181a-5p表達(dá)水平,明確miR-181a-5p與膠質(zhì)瘤替莫唑胺化療耐藥的相關(guān)性。2.通過轉(zhuǎn)染miR-181a-5p模擬物(mimics)和拮抗劑(inhibitors)分別過表達(dá)和抑制miR-181a-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá),采用CCK-8法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞替莫唑胺藥物敏感性的變化,明確miR-181a-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞藥物敏感性的影響。3.通過流式細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),檢測過表達(dá)miR-181a-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的改變,明確miR-181a-5p是否促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.通過細(xì)胞劃痕實驗,觀察miR-181a-5p對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響。5.采用細(xì)胞transwell侵襲實驗,檢測miR-181a-5p對膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞侵襲力的影響,探索miR-181a-5p是否參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性。結(jié)果:1.采用qRT-PCR檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn):miR-181a-5p在膠質(zhì)瘤耐藥細(xì)胞株和化療后復(fù)發(fā)腫瘤組織中呈低表達(dá),兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.通過CCK-8藥物敏感檢測:與對照組相比較,轉(zhuǎn)染了miR-181a-5pmimics的U251TR細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性顯著提高,其TMZ藥物半抑制濃度(IC50值)顯著降低(P0.005);相反,轉(zhuǎn)染了miR-181a-5p inhibitors的U251敏感細(xì)胞對替莫唑胺的敏感性降低,IC50值顯著升高(P0.001)。綜上實驗結(jié)果提示:通過轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)miR-181a-5p表達(dá),可增加GBM細(xì)胞對化療藥物替莫唑胺的敏感性;而下調(diào)miR-181a-5p的表達(dá)則顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的藥物敏感性。提示miR-181a-5p參與膠質(zhì)瘤替莫唑胺耐藥性的調(diào)控。3.采用流式細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組相比較,過表達(dá)miR-181a-5p可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251TR和U251)凋亡率增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.根據(jù)細(xì)胞劃痕和transwell侵襲實驗:與對照組相比,過表達(dá)miR-181a-5p細(xì)胞在24小時的細(xì)胞愈合率顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);而抑制miR-181a-5p表達(dá)后細(xì)胞愈合率則顯著升高(P0.001)。與control組相比較,過表達(dá)miR-181a-5p可顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力(P0.001);然而,下調(diào)miR-181a-5p的表達(dá)則可顯著提高GBM細(xì)胞的侵襲力(P0.001)。結(jié)論:1.MiR-181a-5p可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥物替莫唑胺的敏感性;可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力。2.MiR-181a-5p可誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率增加。提示miR-181a-5p調(diào)控膠質(zhì)瘤化療藥物敏感性有可能是通過影響細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)的,其具體分子機(jī)制需進(jìn)一步探討。
【圖文】：

海南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2. 結(jié)果2.1 膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細(xì)胞 U251TR 和親本細(xì)胞 U251 細(xì)胞形態(tài)前期構(gòu)建 U251TR 為漸次增加膠質(zhì)瘤親本細(xì)胞 U251 培養(yǎng)基中 TMZ 的濃度（約 1 年），并對其 TMZ 耐藥的生物學(xué)特性進(jìn)行了相應(yīng)鑒定。如下圖可以發(fā)現(xiàn)，U251TR 耐藥株在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，表現(xiàn)為失去細(xì)胞極性，并缺乏細(xì)胞與細(xì)胞間緊密連接及黏附連接；細(xì)胞呈松散的、長梭形間葉細(xì)胞形態(tài)；然而，U251 親本細(xì)胞株則表現(xiàn)出鵝卵石上皮樣形態(tài)，細(xì)胞與細(xì)胞間的連接亦比較緊密，表現(xiàn)為成團(tuán)狀簇?fù)砩L（圖 2.1）。

海南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文圖 2.3 標(biāo)記 FAM 片段轉(zhuǎn)染 12 小時后對 U251TR 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果注: （A）U251TR-mimic-NC 組，（B）U251TR-inhibitor-NC 組。Scale bar, 200 μm通過實時熒光定量 PCR 進(jìn)一步檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U251/U251TR）轉(zhuǎn)染前miR-181a-5p 的表達(dá)水平，結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染了 miR-181a-5p mimics 的 U251TR藥細(xì)胞相比陰性對照組顯著升高，組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.491P<0.05）；而轉(zhuǎn)染了 miR-181a-5p inhibitors 的親本 U251 敏感細(xì)胞相比陰性對組顯著降低，，組間的差異亦具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.832，P<0.05）（圖 2.4）
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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本文編號：2705676