【摘要】：第一部份 左旋龍腦暫時性開放血腦屏障增強順鉑治療小鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤效果的研究研究背景：膠質(zhì)瘤是成年人中最常見的顱內(nèi)嚴重惡性腫瘤。其組織學特征為腫瘤細胞侵襲浸潤入腫瘤周圍正常腦組織中。目前標準的膠質(zhì)瘤治療方法為盡可能地安全地手術(shù)切除膠質(zhì)瘤組織,然后行放化療治療。但是,即使膠質(zhì)瘤患者接受了良好的手術(shù)治療以及行放化療后,間變性星形細胞瘤患者的中位生存期也只是接近22個月,而膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存期則僅為16個月。目前,針對膠質(zhì)瘤仍然缺乏有效系統(tǒng)的治療方法。順鉑作為一種鉑類化療藥物現(xiàn)在已經(jīng)在臨床中應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。研究證明順鉑能夠抑制修復酶06-alkylguanine-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而廣泛應(yīng)用于骨肉瘤、移行細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移瘤和生殖細胞腫瘤的治療。但是,由于大腦中血腦屏障的存在,順鉑很難透過血腦屏障,以致只有很少的順鉑可以進入大腦中的腫瘤組織,從而順鉑對顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的治療效果受到了很大的限制。血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)是由內(nèi)皮細胞(endothelial cell)、星形膠質(zhì)細胞(astrocyte)、小膠質(zhì)細胞(microglia)、周細胞(pericyte)和基膜(basal lamina)等組成的復雜網(wǎng)絡(luò)屏障系統(tǒng)。血腦屏障在顱內(nèi)起到了限制外源性分子進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。但是,血腦屏障的這一特征,在保護大腦的同時,也限制了化療藥物通過血液進入腦組織。研究表明血腦屏障的存在限制了98%的小分子和100%的大分子水溶性藥物進入腦組織。雖然許多科研工作者經(jīng)過不斷的努力試圖找到更好的策略和方法促進抗癌藥物透過血腦屏障,例如對血腦屏障造成暫時性的損傷,或者化學修飾化療藥物使其能夠利用大腦內(nèi)源性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入腦組織,提高抗癌藥物透過血腦屏障的能力,但是到目前為止許多實驗結(jié)果都不是很令人滿意。冰片是脂溶性雙環(huán)單萜類莰烷衍生物,由纈草,洋甘菊,薰衣草等植物中提取而得。冰片的使用有著悠久的歷史,在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中就將其作為信使藥物使用。一般來說冰片分為合成冰片和自然冰片兩種。合成冰片一般含有右旋龍腦、左旋龍腦以及異龍腦等。而自然冰片則含有左旋龍腦。有研究顯示異龍腦比左旋龍腦存在更高的粘膜刺激性和肝毒性。另外自然冰片已經(jīng)記錄于中華人民共和國藥典(2005和2010版)中,并且在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中與合成冰片相比更推薦使用自然冰片。美國食品及藥物管理局已經(jīng)批準自然冰片應(yīng)用于食物中,自然冰片已經(jīng)被認為是一種安全的化合物。前期研究證明冰片可以促進血腦屏障的開放并且增加納米顆粒進入腦組織還具有腦保護作用。但是,冰片單體左旋龍腦是否能夠促進順鉑透過血腦屏障目前還不清楚。同樣目前還沒有文獻報道左旋龍腦能否提高順鉑對膠質(zhì)瘤的治療效果,延長荷瘤動物的生存時間。由于順鉑對膠質(zhì)瘤有治療作用,冰片能夠促進血腦屏障開放,從而聯(lián)合順鉑和冰片治療顱內(nèi)腫瘤應(yīng)該是可行的。因此,在本項目中我們研究冰片單體左旋龍腦是否具有提高順鉑透過血腦屏障的能力,從而能夠協(xié)助順鉑治療荷瘤小鼠,最后證明左旋龍腦可以提高順鉑對膠質(zhì)瘤的治療效果。研究目的：1.觀察左旋龍腦對血腦屏障通透性的影響及其時-效、量-效關(guān)系。2.觀察左旋龍腦對實驗小鼠腦含水量及動物行為學的影響,探討其安全性。3.觀察左旋龍腦對順鉑透過血腦屏障的影響。4.研究順鉑聯(lián)合左旋龍腦對膠質(zhì)瘤的治療效果。材料和方法1.左旋龍腦對血腦屏障開放作用的研究：對實驗小鼠腦組織中的依文思藍進行熒光分析和定量檢測,研究左旋龍腦對血腦屏障開放的作用。2.7.0T MR研究左旋龍腦對血腦屏障開放的作用：采用7.0T MR檢測使用左旋龍腦處理實驗小鼠后,實驗小鼠腦組織的磁共振信號變化情況。3.探討左旋龍腦是否會導致實驗小鼠腦水腫：左旋龍腦處理實驗小鼠4h后處死,采用干-濕法檢測實驗動物腦組織含水量。4.探討左旋龍腦是否存在潛在的毒性作用：采用翻正反射評價實驗小鼠服用左旋龍腦后,左旋龍腦是否會對實驗小鼠造成潛在的毒性作用。5.探索左旋龍腦是否能夠促進順鉑透過血腦屏障：采用原子吸收光譜儀檢測使用左旋龍腦后實驗小鼠腦組織中的鉑含量。6.探討左旋龍腦對順鉑治療膠質(zhì)瘤效果的促進作用：采用荷瘤實驗動物的生存期評價左旋龍腦對順鉑治療膠質(zhì)瘤效果的作用。研究結(jié)果：1.左旋龍腦對血腦屏障開放的時-效關(guān)系。實驗小鼠服用左旋龍腦(1,200 mg/kg) 10 min后,腦組織中的依文思藍含量為15.77±0.61 μg/g,20 min后,腦組織中的依文思藍含量為18.55±0.95 μg/g,達到最高峰,30 min后,腦組織中的依文思藍含量開始下降為16.64±1.15μg/g,隨著時間的延長,40,50,60 min組實驗小鼠腦組織中的依文思藍含量明顯下降,分別為8.25±0.57,7.718±1.82和7.302±0.94 μg/g。2.左旋龍腦對血腦屏障開放的量-效關(guān)系。實驗小鼠服用左旋龍腦300,600,900,1200 mg/kg后20 min,腦組織中的依文思藍含量分別為13.42±1.07,12.39±1.05,15.25±0.82和18.55±0.95μg/g,與空白組相比血腦屏障的通透性明顯增高(P0.05)。 應(yīng)用7.0T MR證實服用左旋龍腦后血腦屏障對Gd-DTPA的通透性升高。3.左旋龍腦對腦水腫沒有明顯影響。正常小鼠腦含水量為78.02±0.18%。當實驗小鼠服用300,600和1,200 mg/kg左旋龍腦后4 h,檢測實驗動物腦含水量發(fā)現(xiàn)使用左旋龍腦的實驗小鼠與正常組相比腦含水量沒有明顯差異。4.低劑量的左旋龍腦對實驗動物的動物行為學沒有明顯影響。使用左旋龍腦的劑量為900和1,200 mg/kg對實驗動物的翻正反射有明顯影響,300,600 mg/kg左旋龍腦劑量對實驗小鼠翻正反射沒有明顯影響。5.左旋龍腦可以促進順鉑進入腫瘤組織和瘤旁組織�？诜�300 mg/kg左旋龍腦可以增加瘤旁組織中順鉑含量0.37±0.12μg/g,腫瘤組織中順鉑的含量增加0.44±0.13μg/g。6.左旋龍腦聯(lián)合順鉑治療荷瘤實驗小鼠可以提高膠質(zhì)瘤荷瘤小鼠的生存期。順鉑聯(lián)合左旋龍腦治療小鼠的中位生存時間比單獨使用順鉑治療的小鼠中位生存時間長(24±4.9 v.s.19.3±3.9 d,P0.05)。研究結(jié)論：1.左旋龍腦可暫時性開放實驗小鼠血腦屏障。給藥后10 min血腦屏障通透性增高,20 min后達到最高峰,30 min后逐漸恢復正常。血腦屏障的開放程度對左旋龍腦具有劑量依賴性。2.治療劑量的左旋龍腦不誘發(fā)實驗動物腦水腫,對動物行為學無影響。3.左旋龍腦可以促進順鉑透過血腦屏障進入小鼠腦組織和膠質(zhì)瘤組織,提高順鉑治療荷瘤小鼠的生存期。第二部份雙氫青蒿素的化療增敏作用及誘導膠質(zhì)瘤干細胞凋亡作用機制研究研究背景：膠質(zhì)瘤是成年人最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤。雖然與其他癌癥相比腦腫瘤的發(fā)病率相對較低,但是接受正規(guī)治療的膠質(zhì)瘤患者的中位數(shù)生存期也僅為15個月,而且大多數(shù)腦腫瘤在接受初次治療后9個月內(nèi)復發(fā)。惡性膠質(zhì)瘤的主要組織學特性為腫瘤細胞像樹根一樣向周圍正常腦組織侵襲。迄今為止,手術(shù)治療仍然是膠質(zhì)瘤治療最主要的手段,但即使膠質(zhì)瘤患者在接受標準手術(shù)治療后,連續(xù)接受標準的放化療,其預后仍然很差。因此,許多方法被嘗試用來治療膠質(zhì)瘤,但因為膠質(zhì)瘤的凋亡抵抗能力的存在,阻礙了膠質(zhì)瘤治療的進展�，F(xiàn)在人們正在努力研究新的化合物,希望能夠更有效地殺死具有抗放化療能力的腫瘤細胞。最近有研究報道在腫瘤中存在一群稱為“腫瘤干細胞”的細胞。它們可以調(diào)控腫瘤的形成和生長。膠質(zhì)瘤干細胞(Glioma stem cell, GSCs)已被證明在膠質(zhì)瘤的生長,侵襲,血管生成和免疫逃避中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。他們也被確認為是化療-和放療-抵抗的根源。即使多數(shù)腫瘤細胞被消除后,GSCs也能生存下來并重新創(chuàng)建出新的腫瘤。因此,如果專門針對GSCs進行治療,有望在膠質(zhì)瘤特別是惡性膠質(zhì)母細胞瘤的治療中取得更好的療效。因為膠質(zhì)瘤干細胞具有對化療藥物的抵抗能力,抑制膠質(zhì)瘤干細胞的增長顯得非常困難。最近,一些天然產(chǎn)物被報道具有殺死腫瘤干細胞的作用。雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)是中草藥青蒿中的有效活性成分。并且是目前FDA批準和世衛(wèi)組織建議的安全、有效的主要抗瘧藥物。最近的研究表明,雙氫青蒿素也對肺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌等一些人類惡性腫瘤具有細胞毒性。此外,GSCs對膠質(zhì)瘤的復發(fā)及轉(zhuǎn)移具有促進作用,也代表著膠質(zhì)瘤患者的高死亡率。因此,GSCs被認為是發(fā)展未來癌癥治療方法的一個重要目標或者針對膠質(zhì)瘤干細胞的治療可以改善膠質(zhì)瘤患者的預后。此外絲氨酸／蘇氨酸激酶Akt在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。Akt的活性在膠質(zhì)瘤干細胞中的生物學意義在最近已經(jīng)確立。超表達p-Akt可以抑制細胞凋亡。也就是說,Akt激活能預示膠質(zhì)瘤的預后不良。Akt的磷酸化可以改變Caspase-3、Bcl-2、NF-κB和其他具有誘導或抑制細胞凋亡作用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子的活性。基于p-Akt對膠質(zhì)瘤干細胞具有重要作用的研究結(jié)果,以及雙氫青蒿素的抗膠質(zhì)瘤作用,我們推測雙氫青蒿素可能通過抑制p-Akt在GSC中的表達誘導膠質(zhì)瘤干細胞凋亡。在本研究項目中,我們通過觀察雙氫青蒿素對尼莫司汀(ACNU)的增敏作用,研究雙氫青蒿素對GSCs的影響,專注于凋亡,檢測參與這個過程的p-Akt和Caspase-3的表達情況,闡明在雙氫青蒿素對GSCs產(chǎn)生生物學作用可能的分子機制。研究目的：1.觀察雙氫青蒿素處理后膠質(zhì)瘤干細胞的形態(tài)學改變。2.觀察雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞增殖能力和克隆成形能力的影響。3.觀察雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞細胞周期抑制及誘導細胞凋亡的作用。4.研究雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞作用的潛在分子機制。材料和方法：1.通過免疫熒光的方法對膠質(zhì)瘤干細胞的干細胞標記物CD133, SOX2和Nestin進行檢測。2.采用倒置顯微鏡對雙氫青蒿素處理后的膠質(zhì)瘤干細胞進行形態(tài)學觀察。3.采用CCK-8實驗檢測雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞增殖能力的影響。4.應(yīng)用細胞周期技術(shù)和Annexin-V/PI細胞凋亡流式檢測技術(shù)研究雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞細胞周期和凋亡的作用。5.為了進一步闡述雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞作用的分子機制,采用Western blotting實驗檢測p-Akt和Cleaved Caspase-3的表達水平。研究結(jié)果：1.雙氫青蒿素對ACNU治療膠質(zhì)瘤有增敏作用。2.雙氫青蒿素抑制膠質(zhì)瘤干細胞的細胞活性。雙氫青蒿素處理后的膠質(zhì)瘤干細胞有明顯的形態(tài)學改變且具有量-效關(guān)系。雙氫青蒿素同時抑制GL261膠質(zhì)瘤干細胞和普通膠質(zhì)瘤細胞的細胞活性,而且雙氫青蒿素對膠質(zhì)瘤干細胞的活性抑制強度比普通膠質(zhì)瘤細胞要高,雙氫青蒿素還抑制膠質(zhì)瘤干細胞的克隆形成能力。3.雙氫青蒿素可以抑制膠質(zhì)瘤干細胞的生長。當使用80 gM雙氫青蒿素處理膠質(zhì)瘤干細胞24 h后65.7±2.09%的細胞處于G0/G1,明顯高于空白對照組(51.4±2.59%,P0.05)。80μM雙氫青蒿素處理膠質(zhì)瘤干細胞24 h后,凋亡細胞的數(shù)量為69.26±3.29%,明顯高于對照組(7.9±1.36%,P0.05).4.雙氫青蒿素處理GL261膠質(zhì)瘤干細胞后,p-Akt的表達量隨著雙氫青蒿素濃度的增高而減少,同時Cleaved Caspase-3的表達增高。研究結(jié)論：1.雙氫青蒿素對ACNU治療體外培養(yǎng)GL261膠質(zhì)瘤有增敏作用。2.雙氫青蒿素可影響GL261膠質(zhì)瘤干細胞的形態(tài),抑制其生長和克隆形成能力,阻滯其細胞周期,誘導其凋亡。對GL261膠質(zhì)瘤干細胞的抑制作用比普通膠質(zhì)瘤細胞強。3.雙氫青蒿素可抑制GL261膠質(zhì)瘤干細胞中Akt的活化,增加Cleaved Caspase-3的表達。
【圖文】：

２．４N１巧光顯微鏡觀察逡逑經(jīng)左旋龍腦處理后，各時相點可見實驗小鼠腦組織中有少量的均勻的紅色巧光染色逡逑顆粒，尤其２０邋ｍｉｎ組實驗小鼠腦組織中紅色巧光顆粒染色最為明顯（見圖２．３）；而１０逡逑ｍｉｎ組和３０邋ｍｉｎ組實驗小鼠腦組織中紅色焚光顆粒染色比２０邋ｍｉｎ組要暗淡一些。同時，逡逑４０，邋５０，邋６０邋ｍｉｎ組實驗小鼠腦組織中紅色巧光顆粒染色表現(xiàn)出隨時間延長變的越來越暗逡逑淡的特點。逡逑■■國逡逑圖２．邋３巧光顯微鏡下觀察左旋龍腦促進ＥＢ透過血腦屏除的時－效關(guān)系逡逑２．４１．２定量分析逡逑不同濃度依文思藍巧巧的光密度值（見表２．邋１）Ｗ及ＥＢ標準曲線（見圖２．邋４）。逡逑方程為邋ｙ＝０．０８７９９ｘ＋０．０２０３８逡逑民邋２＝邋０．Ｗ９５逡逑ｙ為溶液中ＥＢ的光密度值，Ｘ為溶液中ＥＢ的濃度山ｇ／ｍｌ）逡逑表２．１不問密度依文思藍（Ｅ巧光密度值逡逑濃度邐８邋ｌｉｇ／ｍｌ邐４邋Ｍ－ｇ／ｍｌ邐２邋［ｉｇ／ｍｌ邐１邋ｆｉｇ／ｍｌ邐０．５邋峭／ｍｌ邋０．２５邋［ｉｇ／ｍｌ逡逑ＯＤ邋值邐０．７３９邐０．３６３邐０．１４５邐０．１２４邐０．０７８邐０．０６０逡逑３５逡逑

經(jīng)不同濃度左旋龍腦處理后２０邋ｍｉｎ，可見３００，邋６００，邋９００，口００邋ｍｇ／ｋｇ實驗小鼠腦組逡逑織中均有不同巧光強度的紅色巧光染色顆粒，尤其１２００邋ｍｇ／ｋｇ組實驗小鼠腦組織中紅色巧逡逑光顆粒染色最為明顯（見圖２．邋６）；而對照組實驗小鼠（空白組和液體石蠟組實驗小鼠）腦組織逡逑中幾乎不可見紅色巧光染色顆粒。同時，從依文思藍（Ｅ巧示蹤腦姐織切片還可觀察到，３００，逡逑６００，邋９００邋ｍｇ／ｋｇ組實驗小鼠腦組織中紅色巧光顆粒染色強度無明顯差異，而且隨著左旋龍逡逑腦濃度的增加，，不同濃度實驗組小鼠腦子ＥＢ含量增加（見圖２．巧。逡逑３７逡逑
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：2704714