【摘要】：目的呼吸道合胞病毒(RSV)感染可以引起兒童急性腦病,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,但尚未闡明其確切的致病機(jī)制。TLR4和核仁素兩種受體都可以介導(dǎo)吸道合胞病毒感染中樞神經(jīng)元。本課題的目的是研究這兩種受體在RSV感染中樞神經(jīng)元中可能的協(xié)同作用,為今后臨床治療以及疾病預(yù)防提供新的思路。方法實(shí)驗(yàn)用TLR4與C23過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,激光共聚焦和免疫共沉淀檢測(cè)它們的共定位和相互作用情況;然后,以TLR4和C23的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y,簡(jiǎn)稱SY5Y)細(xì)胞,再行RSV感染,以未行任何處理的細(xì)胞為正常對(duì)照組,并分別設(shè)立RSV感染組、TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組、TLR4+C23過(guò)表達(dá)組。在RSV感染2h、4h、24h、48h后分別從每個(gè)組收集蛋白以及細(xì)胞的上清液。(1)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)各組不同時(shí)間點(diǎn)p-NF-κB,TLR4及C23蛋白水平的表達(dá)變化;(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time PCR)在每一組不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)TLR4和C23 m RNA表達(dá)的變化;(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8和TNF-α含量的改變情況;(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果(1)激光共聚焦和免疫共沉淀結(jié)果顯示:用TLR4和C23過(guò)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,激光共聚焦觀察到細(xì)胞表面存在共定位;收集細(xì)胞用相應(yīng)抗體孵育處理,進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng)后,免疫印跡檢測(cè)相應(yīng)蛋白表達(dá)的情況顯示:用C23蛋白抗體孵育結(jié)合后可以下拉到TLR4,且TLR4蛋白抗體孵育結(jié)合后也下拉出C23蛋白。提示TLR4和C23存在相互作用。(2)Western Blot結(jié)果顯示:在正常對(duì)照組中,p-NF-κB蛋白的表達(dá)量較低,經(jīng)RSV病毒感染之后,隨著感染時(shí)間增加蛋白表達(dá)量不斷增加;與RSV感染組相比,TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組,TLR4+C23過(guò)表達(dá)組的p-NF-κB表達(dá)量均有所增加,其中TLR4過(guò)表達(dá)組相對(duì)于同時(shí)間點(diǎn)的C23過(guò)表達(dá)組增加的更明顯,而且TLR4+C23過(guò)表達(dá)組的p-NF-κB表達(dá)量最高,差異從2h開始具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TLR4蛋白在正常對(duì)照組中表達(dá)量較低,RSV感染后表達(dá)上升,2h開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與RSV感染組相比,TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組,TLR4+C23過(guò)表達(dá)組的表達(dá)量均有所增加,同時(shí)間點(diǎn)TLR4+C23過(guò)表達(dá)組中的表達(dá)量顯著高于單獨(dú)過(guò)表達(dá)組。C23蛋白在各組細(xì)胞中的變化也檢測(cè)到類似的結(jié)果。(3)Real-time PCR結(jié)果顯示:正常細(xì)胞中TLR4 m RNA含量較低,RSV感染后TLR4 m RNA表達(dá)上升,2h開始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與RSV感染組相比,TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組中表達(dá)量都顯著升高;其中,TLR4+C23過(guò)表達(dá)組的表達(dá)量最高,差異從2h開始具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P0.01)。C23 m RNA的表達(dá)檢測(cè)到與TLR4 m RNA類似的結(jié)果。(4)ELISA結(jié)果顯示:正常對(duì)照組中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)量較低,經(jīng)RSV感染后,SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-6、IL-8和TNF-α的含量,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高,均高于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)量顯著升高(P0.01),且TLR4過(guò)表達(dá)組升高更明顯,其中,TLR4+C23過(guò)表達(dá)組的表達(dá)量最高。差異有顯著性(P0.05)。(5)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:正常組SY5Y細(xì)胞凋亡較少;RSV作用24 h后,RSV感染組細(xì)胞凋亡增加,凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);TLR4過(guò)表達(dá)組、C23過(guò)表達(dá)組與RSV組相比,細(xì)胞凋亡較為明顯升高,與RSV組相比凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);TLR4+C23過(guò)表達(dá)組與RSV組相比細(xì)胞凋亡變化更為明顯,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在感染后48 h,各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)到與24h相似的表達(dá)趨勢(shì),但均比24h時(shí)增加的更加顯著。結(jié)論TLR4和C23可以相互作用共同促進(jìn)RSV活化NF-κB,導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路下游細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)增高和細(xì)胞凋亡,表明兩受體在RSV感染SY5Y細(xì)胞所致?lián)p傷中起到協(xié)同作用。
【圖文】：

圖.呂血d月On

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文為對(duì)照，采用 Western Blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 24h 后受蛋白的表達(dá)明顯增高，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果較好，且與對(duì)照比較增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.01）。以上結(jié)果判斷本實(shí)驗(yàn)成功將 TLR4 或 C23 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 SY5Y 細(xì)胞，在接下來(lái)實(shí)驗(yàn)選取 24h 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染時(shí)間點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)下圖 2。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.9

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6 蒙國(guó)照;曾思恩;周英瓊;李運(yùn)千;肖勝軍;;細(xì)胞表面核仁素表達(dá)下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)日程及論文匯編[C];2010年

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本文編號(hào)：2704560