【摘要】：背景:腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,呈浸潤性生長,手術(shù)難以完全切除,臨床病情進展快,預(yù)后差,具有高侵襲性和破壞力、復發(fā)率高、放化療抵抗等特點。高級別腦膠質(zhì)瘤尤其是多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)的致死率極高,5年存活率不超過5%。對腦膠質(zhì)瘤的治療目前遇到的一個重要挑戰(zhàn)是膠質(zhì)瘤細胞具有誘導產(chǎn)生局部和系統(tǒng)性免疫抑制的能力,從而限制了固有免疫對腫瘤的防御和適應(yīng)性免疫治療的療效。腦膠質(zhì)瘤具有多種方式逃避機體的免疫監(jiān)控,這一免疫逃逸過程受腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境(Tumor Microenvironment,TME)的共同影響。研究表明,作為“種子”的膠質(zhì)瘤干細胞(Glioma Stem Cells,GSCs)和作為“土壤”的腫瘤微環(huán)境在腦膠質(zhì)瘤的免疫逃逸中起著十分重要的作用。目前對與免疫逃逸有關(guān)的細胞表面分子研究較多的是共刺激分子B7家族,其中負性共刺激分子PD-L1是目前研究的熱點之一。在腦膠質(zhì)瘤組織中,GSCs、腫瘤微環(huán)境中的主要細胞—腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated Macrophages,TAMs)和負性共刺激分子PD-L1是同時存在的,以往的報道多僅研究負性共刺激分子PD-L1在兩種細胞中各自的表達情況,同時研究三者在腦膠質(zhì)瘤免疫逃逸機制中的作用,國內(nèi)外鮮見報道。目的:本研究將在蛋白和mRNA水平探討不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中GSCs、TAMs和負性共刺激分子PD-L1的表達情況及其之間的相關(guān)性,并以負性共刺激分子PD-L1為橋梁探索GSCs和TAMs在腦膠質(zhì)瘤免疫逃逸行為中的關(guān)系以及可能的治療靶點。方法:以CD133作為膠質(zhì)瘤干細胞的標志物,以CD68作為腫瘤相關(guān)巨噬細胞的標志物。采用免疫熒光雙染法檢測不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中CD68和PD-L1蛋白的共表達情況;采用免疫組化SP法在蛋白水平檢測不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、CD68和PD-L1蛋白的表達情況及其之間的相關(guān)性;采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time fluorescent PCR,qRT-PCR)技術(shù)從mRNA水平檢測不同病理級別腦膠質(zhì)瘤組織中CD133、CD68和PD-L1基因的表達情況及其之間的相關(guān)性。結(jié)果:1.免疫熒光雙染法實驗結(jié)果顯示:所有腦膠質(zhì)瘤組織中均有CD68和PD-L1蛋白的表達,主要位于細胞膜及細胞漿;雙重熒光染色結(jié)果顯示大部分PD-L1分子表達于TAMs上,即大部分PD-L1陽性細胞為腫瘤相關(guān)巨噬細胞;隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高,CD68和PD-L1蛋白的共表達增加。2.免疫組化實驗結(jié)果顯示:所有腦膠質(zhì)瘤組織中均有CD133、CD68和PD-L1蛋白的表達,主要表達于細胞漿中,少量表達于細胞膜上,多呈黃色或者棕黃色顆粒;隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高,CD133、CD68和PD-L1蛋白的表達量逐漸增加,Spearman秩相關(guān)分析顯示在腦膠質(zhì)瘤組織中,CD133、CD68和PD-L1蛋白的表達水平與病理級別呈正相關(guān)(r=0.831,P0.001;r=0.795,P0.001;r=0.711,P0.001);CD133、CD68和PD-L1蛋白在高級別組腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于低級別組腦膠質(zhì)瘤組織(t=13.854,P0.001;t=12.838,P0.001;t=6.794,P0.001);Spearman秩相關(guān)分析顯示腦膠質(zhì)瘤組織中CD133蛋白與CD68蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.881,P0.001),并且低級別組中CD133與CD68蛋白呈正相關(guān)(r=0.425,P=0.024),高級別組中CD133與CD68蛋白也呈正相關(guān)(r=0.620,P0.001);CD133蛋白與PD-L1蛋白的表達呈正相關(guān)(r=0.753,P0.001),并且低級別組中CD133與PD-L1蛋白呈正相關(guān)(r=0.432,P=0.022),高級別組中CD133與PD-L1蛋白也呈正相關(guān)(r=0.407,P=0.031)。3.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高,CD133、CD68和PD-L1基因mRNA的表達量逐漸增加,Spearman秩相關(guān)分析顯示在腦膠質(zhì)瘤組織中,CD133、CD68和PD-L1基因mRNA的表達水平與病理級別呈正相關(guān)(r=0.647,P0.001;r=0.499,P0.001;r=0.445,P=0.001);兩樣本比較的秩和檢驗結(jié)果顯示CD133、CD68和PD-L1基因mRNA在高級別組腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于低級別組腦膠質(zhì)瘤組織(z=6.424,P0.001;z=3.556,P0.001;z=2.999,P=0.003);Spearman秩相關(guān)分析顯示腦膠質(zhì)瘤組織中CD133基因mRNA與CD68基因mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.525,P0.001),并且低級別組中CD133與CD68基因mRNA呈正相關(guān)(r=0.518,P=0.005),高級別組中CD133與CD68基因mRNA也呈正相關(guān)(r=0.500,P=0.007);CD133基因mRNA與PD-L1基因mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.431,P0.001),并且低級別組中CD133與PD-L1基因mRNA呈正相關(guān)(r=0.398,P=0.036),高級別組中CD133與PD-L1基因mRNA也呈正相關(guān)(r=0.417,P=0.027)。結(jié)論:1.腦膠質(zhì)瘤組織中負性共刺激分子PD-L1主要由腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞表達。2.CD133、CD68和PD-L1的表達與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān);GSCs與表達負性共刺激分子PD-L1的TAMs呈正相關(guān)。
【圖文】：

膠質(zhì)瘤干細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞和負性共刺激分子 PD-L1 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及其意義 2018 屆碩士學位論文二、結(jié)果1. CD68 和 PD-L1 蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中的共表達情況免疫熒光雙染法實驗結(jié)果顯示：所有腦膠質(zhì)瘤組織中均有CD68和PD-L1蛋白的表達，，主要位于細胞膜及細胞漿；CD68 陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光，PD-L1陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光，雙重陽性細胞呈現(xiàn)黃色熒光，雙重熒光染色結(jié)果顯示大部分 PD-L1 分子表達于 TAMs 上，即大部分 PD-L1 陽性細胞為腫瘤相關(guān)巨噬細胞；隨著腦膠質(zhì)瘤病理級別的升高，CD68 和 PD-L1 蛋白的共表達增加（見圖 1、2）。

圖 2 CD68 與 PD-L1 蛋白在高級別腦膠質(zhì)瘤組織中的共表達（免疫熒光雙染，×400）A：CD68 陽性細胞呈現(xiàn)綠色熒光；B：PD-L1 陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光；C：CD68 與 PD-L1 免疫熒光雙染疊加圖像，雙重陽性細胞呈現(xiàn)黃色熒光，共表達較多Fig.2 Co-expression of CD68 and PD-L1 protein in high-grade glioma tissues (Doubleimmunofluorescence staining, ×400)A: CD68 positive cells showed green fluorescence; B: PD-L1 positive cells showed red fluorescence; C:Double positive cells of CD68 and PD-L1 showed yellow fluorescence, more co-expression
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：2704342