【摘要】：研究目的:實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalo-myelitis,EAE)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥脫髓鞘、神經(jīng)傳導(dǎo)受損和癱瘓為特征,是一種典型的自身免疫性神經(jīng)退行性疾病,是多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)的成熟動(dòng)物模型。盡管多發(fā)性硬化癥的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,但多項(xiàng)研究證實(shí),外周初始CD4~+T細(xì)胞分化為輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)亞群的過(guò)程失調(diào),以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中分泌IL-17細(xì)胞因子的Th17細(xì)胞浸潤(rùn)增多,與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-181家族是一類重要的Th細(xì)胞亞群調(diào)控因子,但作為其家族成員之一,miR-181c在是否可通過(guò)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎病理發(fā)生方面的研究尚屬空白。因此,本研究擬探究miR-181c在Th17細(xì)胞分化和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用與機(jī)制。方法:通過(guò)檢測(cè)EAE小鼠在發(fā)病不同階段的體內(nèi)miR-181c的表達(dá)量變化,確定miR-181c與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)。利用重組慢病毒(Lentivirus),構(gòu)建敲低miR-181c表達(dá)的小鼠,通過(guò)RT-PCR和GFP免疫熒光染色驗(yàn)證敲低和感染效率。分組誘導(dǎo)EAE小鼠模型,比較敲低miR-181c表達(dá)后對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的影響,并通過(guò)脊髓切片的H.E.和Fast blue染色,評(píng)估CNS中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及脫髓鞘的程度。分離小鼠發(fā)病初期以及高峰期時(shí)的外周淋巴細(xì)胞和中樞內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞,流式檢測(cè)與EAE發(fā)病高度相關(guān)的輔助性T細(xì)胞亞群(Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞)的比例變化。通過(guò)原代細(xì)胞體外定向分化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)miR-181c在不同Th細(xì)胞亞群中的表達(dá),并通過(guò)流式和RT-PCR檢測(cè)敲低miR-181c表達(dá)后對(duì)Th細(xì)胞分化的影響。通過(guò)生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)miR-181c可能影響的信號(hào)通路并進(jìn)一步預(yù)測(cè)靶基因,通過(guò)Western blot和熒光素酶報(bào)告基因等實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步功能性驗(yàn)證。此外,通過(guò)對(duì)Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)中的已發(fā)表的研究多發(fā)性硬化癥患者和健康對(duì)照受試者miRNA表達(dá)譜的項(xiàng)目進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探究多發(fā)性硬化癥患者中miR-181c水平變化。結(jié)果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)敲低miR-181c表達(dá)的小鼠可延遲實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)發(fā)病并降低了其臨床評(píng)分,分離EAE小鼠外周及中樞內(nèi)淋巴細(xì)胞經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn),其體內(nèi)的輔助性T細(xì)胞亞群中,Th17細(xì)胞比例呈現(xiàn)明顯減少。經(jīng)進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究后,我們發(fā)現(xiàn)miR-181c在Th17細(xì)胞中呈特異性高表達(dá),并且TGF-β信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Smad7是miR-181c的潛在靶基因。高表達(dá)miR-181c及熒光素酶報(bào)告研究顯示miR-181c可直接抑制Smad7表達(dá)。敲低miR-181c后Smad7表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)可阻礙T細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的Smad2/3激活,增強(qiáng)Th17細(xì)胞分化負(fù)性調(diào)節(jié)因子IL-2的表達(dá),進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞的分化。此外,通過(guò)對(duì)Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)中的已發(fā)表的研究多發(fā)性硬化癥(MS)患者和健康對(duì)照受試者miRNA表達(dá)譜的項(xiàng)目進(jìn)行了分析,我們發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比,多發(fā)性硬化癥(MS)患者的外周血中miR-181c水平相對(duì)升高,而Smad7的表達(dá)水平相對(duì)降低。結(jié)論:敲低miR-181c表達(dá)可降低實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病程度,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘。miR-181c在Th17細(xì)胞中呈特異性高表達(dá);miR-181c可靶向抑制Smad7基因表達(dá),解除Smad7對(duì)TGF-β介導(dǎo)的Smad信號(hào)通路的抑制作用,進(jìn)而增強(qiáng)Smad信號(hào)通路激活對(duì)IL-2自分泌的抑制作用,最終促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。此外,通過(guò)對(duì)Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)中的已發(fā)表的研究多發(fā)性硬化癥患者和健康對(duì)照受試者miRNA表達(dá)譜的項(xiàng)目進(jìn)行了分析,與健康對(duì)照組相比,多發(fā)性硬化癥患者的外周血中miR-181c水平相對(duì)升高。我們的研究結(jié)果確定了一種新的與Th17細(xì)胞分化和自身免疫密切相關(guān)的miRNA,miR-181c可能成為多發(fā)性硬化癥患者治療的潛在靶點(diǎn)。我們的研究為進(jìn)一步探究多發(fā)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制提供了線索,并可能為以后多發(fā)性硬化癥患者的診斷和治療提供新選擇。
【圖文】：

論文 一、體內(nèi)研究：microRNA-1c 在 EAE 小鼠發(fā)病初期和高峰期表達(dá)升CD4+T 細(xì)胞在 EAE 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起改變與 EAE 的發(fā)生發(fā)展是否存在關(guān)聯(lián)病初期、EAE 發(fā)病高峰期、EAE 緩解淋巴結(jié)（腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)行檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)，與 WT 組相比，在 EAE 發(fā)病初期和發(fā)病高峰期呈明顯iR-181c 表達(dá)水平與 WT 組大致相當(dāng)（

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、體內(nèi)研究：microRNA-181c 對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎發(fā)病的影響研磨器官組織細(xì)胞提取 RNA 檢測(cè)，轉(zhuǎn)染重組慢病毒后，肝臟、淋巴結(jié)、脾臟中miR-181c 表達(dá)呈顯著降低（圖 2 A，B）。由于已有研究表明同家族的 miR-181a和 miR-181b 可影響 EAE 的發(fā)病，因此我們同時(shí)對(duì)慢病毒敲低 miRNA 的特異性也進(jìn)行了驗(yàn)證，在轉(zhuǎn)染了 LV-sh-miR-181c 慢病毒的淋巴結(jié)和脾臟細(xì)胞中，miR-181a 和 miR-181b 的表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯改變（圖 2 C）。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R744.51

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本文編號(hào)：2704254