【摘要】：目的:探討在6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型中P2X4受體及凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)情況,調(diào)控ATP-P2X4受體信號軸對凋亡蛋白caspase-3相對表達(dá)量的影響。方法:本實驗選取雄性Wistar大鼠為實驗對象,將大鼠隨機分成8組,每組20只。將大鼠麻醉,準(zhǔn)確定位左側(cè)黑質(zhì)后,按照以下方式處理各組實驗動物:空白對照組、6-OHDA組大鼠黑質(zhì)注射含0.3%抗壞血酸的生理鹽水,攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組黑質(zhì)內(nèi)注射攜帶空載si-RNA慢病毒,攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒6-OHDA組黑質(zhì)內(nèi)注射攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒,攜帶抑制性si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組注射攜帶抑制性si-RNA慢病毒。在適應(yīng)實驗環(huán)境1周后,構(gòu)建大鼠PD模型,在上述空白及陰性對照組動物腦內(nèi)含0.3%抗壞血酸的生理鹽水,在上述各6-OHDA組大鼠黑質(zhì)中注射6-OHDA溶液。造模后飼養(yǎng)1周進(jìn)行阿撲嗎啡誘發(fā)實驗,篩選旋轉(zhuǎn)實驗陽性的成功PD動物模型。將大鼠處死后,對其腦組織進(jìn)行冰凍切片及免疫熒光染色,計數(shù)TH陽性多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。分離提取大鼠黑質(zhì)總RNA及總蛋白,利用熒光實時定量PCR及蛋白印跡法檢測各組大鼠中P2X4受體及凋亡蛋白caspase-3的mRNA及蛋白相對表達(dá)量。結(jié)果:1、利用免疫熒光法檢測TH陽性的多巴能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量:與空白對照組相比,6-OHDA組TH陽性多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.01),攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組細(xì)胞數(shù)無明顯差異。在與攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組對比中,攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒6-OHDA組細(xì)胞數(shù)明顯減少,攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組則有所增加,兩者均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2、PCR法檢測caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量:與空白對照組大鼠黑質(zhì)中caspase-3 mRNA的表達(dá)相比較,6-OHDA組明顯升高(P0.01)。攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒6-OHDA組較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組大鼠黑質(zhì)caspase-3 mRNA的表達(dá)升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組表達(dá)較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組降低(P0.05)。3、western blot檢測大鼠黑質(zhì)中caspase-3蛋白的相對表達(dá)量:與空白對照組相比,6-OHDA組蛋白表達(dá)增加(P0.01)。對比攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組,攜帶過表達(dá)si-RNA慢病毒6-OHDA組caspase-3蛋白表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);而攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組大鼠黑質(zhì)中的蛋白較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:當(dāng)P2X4受體基因過表達(dá)時,caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)均增高,引起黑質(zhì)內(nèi)功能細(xì)胞丟失增多。當(dāng)抑制P2X4受體基因表達(dá)時,caspase-3基因及蛋白的表達(dá)均較攜帶空載病毒的PD大鼠下降,相應(yīng)地減少了黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的丟失。ATP-P2X4受體信號軸能夠在帕金森病模型中,可通過調(diào)控caspase-3的表達(dá)參與其發(fā)病過程。
【圖文】：

圖 1 慢病毒在黑質(zhì) TH 陽性多巴胺能細(xì)胞中的表達(dá)情況（400 倍）注：a 圖為酪氨酸羥化酶在黑質(zhì)中表達(dá)的情況；b 圖為慢病毒在黑質(zhì)中表達(dá)的情況；c 圖是a 圖和 b 圖的融合圖像，顯示慢病毒在黑質(zhì) TH 陽性多巴胺能細(xì)胞中的表達(dá)情況用熒光顯微鏡觀察各組大鼠黑質(zhì)切片標(biāo)本，，計數(shù)各切片中 TH 陽性多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量并比較（圖 2）。通過分析比較可得，與空白對照組（7336 ± 83.16）相比，6-OHDA 組 TH 陽性多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（4303 ± 106.3）明顯減少（P<0.01）；攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性對照組細(xì)胞數(shù)（7212 ± 217.8）無明顯差異。在與攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性 6-OHDA 組對比中，攜帶過表達(dá) si-RNA 慢病毒 6-OHDA組細(xì)胞數(shù)（3393 ± 95.44）明顯減少，攜帶抑制性 si-RNA 慢病毒 6-OHDA 組（4929 ±123.7）則有所增加，兩者均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。如圖 2、圖 3、表 1 所示。

13圖 2 各組大鼠黑質(zhì)中 TH 陽性多巴胺能神經(jīng)元（免疫熒光染色，100 倍）為空白對照組，b 為 6-OHDA 組，c 為攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性對照組A 慢病毒 6-OHDA 組，e 為攜帶過表達(dá) si-RNA 慢病毒陰性對照組，f 為攜帶毒 6-OHDA 組，g 為攜帶抑制性 si-RNA 慢病毒陰性對照組，h 為攜帶抑制性慢病毒 6-OHDA 組表 1 各組大鼠黑質(zhì)中 TH 陽性細(xì)胞數(shù)量（X± S）（個）TH 陽性多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量 P 值
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R742.5

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本文編號：2702488