【摘要】：目的:探討在6-OHDA誘導的帕金森大鼠模型中P2X4受體及凋亡蛋白caspase-3的表達情況,調控ATP-P2X4受體信號軸對凋亡蛋白caspase-3相對表達量的影響。方法:本實驗選取雄性Wistar大鼠為實驗對象,將大鼠隨機分成8組,每組20只。將大鼠麻醉,準確定位左側黑質后,按照以下方式處理各組實驗動物:空白對照組、6-OHDA組大鼠黑質注射含0.3%抗壞血酸的生理鹽水,攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組黑質內注射攜帶空載si-RNA慢病毒,攜帶過表達si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶過表達si-RNA慢病毒6-OHDA組黑質內注射攜帶過表達si-RNA慢病毒,攜帶抑制性si-RNA慢病毒陰性對照組、攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組注射攜帶抑制性si-RNA慢病毒。在適應實驗環(huán)境1周后,構建大鼠PD模型,在上述空白及陰性對照組動物腦內含0.3%抗壞血酸的生理鹽水,在上述各6-OHDA組大鼠黑質中注射6-OHDA溶液。造模后飼養(yǎng)1周進行阿撲嗎啡誘發(fā)實驗,篩選旋轉實驗陽性的成功PD動物模型。將大鼠處死后,對其腦組織進行冰凍切片及免疫熒光染色,計數(shù)TH陽性多巴胺能神經細胞數(shù)量。分離提取大鼠黑質總RNA及總蛋白,利用熒光實時定量PCR及蛋白印跡法檢測各組大鼠中P2X4受體及凋亡蛋白caspase-3的mRNA及蛋白相對表達量。結果:1、利用免疫熒光法檢測TH陽性的多巴能神經細胞數(shù)量:與空白對照組相比,6-OHDA組TH陽性多巴胺能神經細胞數(shù)量明顯減少(P0.01),攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組細胞數(shù)無明顯差異。在與攜帶空載si-RNA慢病毒陰性對照組對比中,攜帶過表達si-RNA慢病毒6-OHDA組細胞數(shù)明顯減少,攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組則有所增加,兩者均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。2、PCR法檢測caspase-3 mRNA的相對表達量:與空白對照組大鼠黑質中caspase-3 mRNA的表達相比較,6-OHDA組明顯升高(P0.01)。攜帶過表達si-RNA慢病毒6-OHDA組較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組大鼠黑質caspase-3 mRNA的表達升高,具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組表達較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組降低(P0.05)。3、western blot檢測大鼠黑質中caspase-3蛋白的相對表達量:與空白對照組相比,6-OHDA組蛋白表達增加(P0.01)。對比攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組,攜帶過表達si-RNA慢病毒6-OHDA組caspase-3蛋白表達明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);而攜帶抑制性si-RNA慢病毒6-OHDA組大鼠黑質中的蛋白較攜帶空載si-RNA慢病毒6-OHDA組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結論:當P2X4受體基因過表達時,caspase-3 mRNA和蛋白的表達均增高,引起黑質內功能細胞丟失增多。當抑制P2X4受體基因表達時,caspase-3基因及蛋白的表達均較攜帶空載病毒的PD大鼠下降,相應地減少了黑質內多巴胺能神經元的丟失。ATP-P2X4受體信號軸能夠在帕金森病模型中,可通過調控caspase-3的表達參與其發(fā)病過程。
【圖文】：

圖 1 慢病毒在黑質 TH 陽性多巴胺能細胞中的表達情況（400 倍）注：a 圖為酪氨酸羥化酶在黑質中表達的情況；b 圖為慢病毒在黑質中表達的情況；c 圖是a 圖和 b 圖的融合圖像，顯示慢病毒在黑質 TH 陽性多巴胺能細胞中的表達情況用熒光顯微鏡觀察各組大鼠黑質切片標本，，計數(shù)各切片中 TH 陽性多巴胺能神經細胞的數(shù)量并比較（圖 2）。通過分析比較可得，與空白對照組（7336 ± 83.16）相比，6-OHDA 組 TH 陽性多巴胺能神經細胞數(shù)量（4303 ± 106.3）明顯減少（P<0.01）；攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性對照組細胞數(shù)（7212 ± 217.8）無明顯差異。在與攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性 6-OHDA 組對比中，攜帶過表達 si-RNA 慢病毒 6-OHDA組細胞數(shù)（3393 ± 95.44）明顯減少，攜帶抑制性 si-RNA 慢病毒 6-OHDA 組（4929 ±123.7）則有所增加，兩者均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。如圖 2、圖 3、表 1 所示。

13圖 2 各組大鼠黑質中 TH 陽性多巴胺能神經元（免疫熒光染色，100 倍）為空白對照組，b 為 6-OHDA 組，c 為攜帶空載 si-RNA 慢病毒陰性對照組A 慢病毒 6-OHDA 組，e 為攜帶過表達 si-RNA 慢病毒陰性對照組，f 為攜帶毒 6-OHDA 組，g 為攜帶抑制性 si-RNA 慢病毒陰性對照組，h 為攜帶抑制性慢病毒 6-OHDA 組表 1 各組大鼠黑質中 TH 陽性細胞數(shù)量（X± S）（個）TH 陽性多巴胺能神經細胞數(shù)量 P 值
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 楊琪;趙星皓;卓少元;;Caspase-1與腫瘤相關性研究進展[J];中華中醫(yī)藥學刊;2019年01期

2 夏憶;盧建遠;何向東;陳瑩;字向東;;牦牛Caspase-3克隆、序列分析與組織表達研究[J];西南民族大學學報(自然科學版);2019年05期

3 張詩田;張達;牛文彥;;肥胖患者炎性單核細胞Caspase活性的研究[J];天津醫(yī)科大學學報;2017年02期

4 李學玲;董紅芬;;血清IL-18、Caspase-3水平與新生兒缺氧缺血性腦病的相關性[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2016年03期

5 張瀟月;孔慶宏;王冠林;張寬仁;;Procaspase-8/Caspase-8非凋亡作用的研究進展[J];生命的化學;2016年05期

6 黃巧麗;周華;李濤;;Caspase的非凋亡性作用[J];生命的化學;2015年03期

7 Fatih 噻elik;Fatih Ulas;Zeynep Günes 銉zünal;Tülin F|rat;Serdal 噻elebi;

本文編號：2702488