【摘要】：背景和目的:腦出血是一種嚴重危害健康的疾病,但目前仍缺乏有效的治療手段。免疫和炎癥在腦出血后的繼發(fā)性腦損傷過程中起到重要作用。腦出血發(fā)生后,外周血中的白細胞等成分進入腦組織,激活小膠質細胞等腦內固有細胞,共同促進局部炎癥因子的產生。這些炎癥因子與細胞死亡后的裂解產物一起,加速血腦屏障的破壞,損傷病灶周圍腦實質,造成血腫周圍水腫的擴大并加重占位效應,從而使腦組織受到嚴重損傷。NLRP3(Pyrin Domain-Containing Protein 3,熱蛋白結構域相關蛋白3)炎癥小體是一種多蛋白復合體,可被多種信號所激活,包括細菌、真菌、病毒成分、內源性的危險信號以及環(huán)境中的微粒。作為組織損傷時天然免疫反應的重要組成部分,NLRP3炎癥小體在腦出血后被激活,促進神經炎癥并加重腦水腫。MCC950是一種小分子化合物,能夠選擇性地抑制NLRP3炎癥小體的激活,并在nM濃度即發(fā)揮作用。因此,我們利用MCC950和兩種小鼠腦出血模型來系統(tǒng)研究,使用藥理學手段選擇性地抑制NLRP3炎癥小體對出血性腦損傷和神經炎癥的影響。方法:以成年雄性C57BL/6小鼠作為實驗對象,通過向基底節(jié)區(qū)注射自體血或膠原酶建立腦出血模型。在小鼠腦出血模型建立后,立即給予小鼠MCC950(10 mg/kg)或相同體積溶劑腹腔注射,連續(xù)3天,每天一次。對于假手術組小鼠,可注射一定體積的生理鹽水,注射的量與MCC950體積相同。在模型建立后第1天和第3天,通過mNSS評分和轉角試驗對小鼠進行神經功能評估。在模型建立后第3天,通過核磁共振來計算小鼠病灶和血腫體積;通過核磁共振和干濕重法評價水腫體積;通過流式細胞術檢測外周白細胞如中性粒細胞、巨噬細胞的浸潤以及腦組織小膠質細胞促炎因子的產生;通過RT-PCR技術檢測炎癥小體各組分NLRP3、caspase-1、ASC以及IL-1βmRNA的表達;通過免疫印跡法分析NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達;應用伊文思藍定性定量測定血腦屏障滲漏情況和蛋白質印記法檢測緊密連接蛋白的表達。同時,刪除小鼠小膠質細胞和Gr-1~+的髓系細胞后,檢測MCC950是否對腦出血有保護作用。刪除小膠質細胞的方法為:造模前用PLX3397(40 mg/kg)連續(xù)給小鼠灌胃21天,造模后繼續(xù)給藥直到實驗結束。刪除Gr-1~+的髓系細胞的方法為:在小鼠造模的前一天和后一天分別給小鼠腹腔注射250μg抗小鼠Gr-1單克隆抗體。結果:在自體血或者膠原酶誘導的腦出血小鼠中,MCC950減少了腦出血后腦內IL-1β(白介素-1β)的產生,并減輕了腦出血所引起的神經功能損傷和血腫周圍的腦水腫。在自體血誘導的腦出血小鼠中,MCC950減少了腦出血后腦組織的白細胞浸潤,同時減少了小膠質細胞IL-6的產生。MCC950能夠減輕血腦屏障的破壞,減少細胞的死亡。而且,在刪除了小膠質細胞或者Gr-1~+的髓系細胞以后,MCC950的保護作用消失。結論:以上研究結果說明選擇性NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950能夠減輕出血性損傷和神經炎癥。NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950有潛力成為一種治療腦出血的選擇,有進一步研究的價值。
【圖文】：

MCC950減輕腦出血后腦損傷并改善長期預后通過向C57BL/6小鼠基底節(jié)區(qū)注射自體血或膠原酶來誘導腦出血模型

圖 2. MCC950 抑制 NLRP3 炎癥小體的激活和 IL-1β 的表達通過向 C57BL/6 小鼠尾狀核注射自體血誘導腦出血模型。腦出血模型誘導后，小鼠立即接受 MCC950（10 mg/kg）或相同體積溶劑腹腔注射，連續(xù) 3 天，每天一次。 3 天后，分別取 MCC950 組、溶劑組和假手術組小鼠腦組織提取 mRNA和蛋白。圖 A. 小鼠腦組織內炎癥小體各組分和 IL-1β mRNA 的表達水平。B. 免疫印跡法分析各組小鼠腦組織 NLRP3、IL-1β、caspase-1 蛋白的表達情況。C. 圖中所示為各組小鼠 NLRP3、IL-1β、caspase-1 蛋白的表達水平。每組 n=6。所有數據由均數±標準差來表示，*P＜0.05，**P＜0.01。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743.34

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本文編號：2701341