【摘要】：背景和目的:腦出血是一種嚴(yán)重危害健康的疾病,但目前仍缺乏有效的治療手段。免疫和炎癥在腦出血后的繼發(fā)性腦損傷過程中起到重要作用。腦出血發(fā)生后,外周血中的白細(xì)胞等成分進(jìn)入腦組織,激活小膠質(zhì)細(xì)胞等腦內(nèi)固有細(xì)胞,共同促進(jìn)局部炎癥因子的產(chǎn)生。這些炎癥因子與細(xì)胞死亡后的裂解產(chǎn)物一起,加速血腦屏障的破壞,損傷病灶周圍腦實(shí)質(zhì),造成血腫周圍水腫的擴(kuò)大并加重占位效應(yīng),從而使腦組織受到嚴(yán)重?fù)p傷。NLRP3(Pyrin Domain-Containing Protein 3,熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3)炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合體,可被多種信號所激活,包括細(xì)菌、真菌、病毒成分、內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號以及環(huán)境中的微粒。作為組織損傷時(shí)天然免疫反應(yīng)的重要組成部分,NLRP3炎癥小體在腦出血后被激活,促進(jìn)神經(jīng)炎癥并加重腦水腫。MCC950是一種小分子化合物,能夠選擇性地抑制NLRP3炎癥小體的激活,并在nM濃度即發(fā)揮作用。因此,我們利用MCC950和兩種小鼠腦出血模型來系統(tǒng)研究,使用藥理學(xué)手段選擇性地抑制NLRP3炎癥小體對出血性腦損傷和神經(jīng)炎癥的影響。方法:以成年雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,通過向基底節(jié)區(qū)注射自體血或膠原酶建立腦出血模型。在小鼠腦出血模型建立后,立即給予小鼠MCC950(10 mg/kg)或相同體積溶劑腹腔注射,連續(xù)3天,每天一次。對于假手術(shù)組小鼠,可注射一定體積的生理鹽水,注射的量與MCC950體積相同。在模型建立后第1天和第3天,通過mNSS評分和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評估。在模型建立后第3天,通過核磁共振來計(jì)算小鼠病灶和血腫體積;通過核磁共振和干濕重法評價(jià)水腫體積;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周白細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤以及腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子的產(chǎn)生;通過RT-PCR技術(shù)檢測炎癥小體各組分NLRP3、caspase-1、ASC以及IL-1βmRNA的表達(dá);通過免疫印跡法分析NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達(dá);應(yīng)用伊文思藍(lán)定性定量測定血腦屏障滲漏情況和蛋白質(zhì)印記法檢測緊密連接蛋白的表達(dá)。同時(shí),刪除小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞和Gr-1~+的髓系細(xì)胞后,檢測MCC950是否對腦出血有保護(hù)作用。刪除小膠質(zhì)細(xì)胞的方法為:造模前用PLX3397(40 mg/kg)連續(xù)給小鼠灌胃21天,造模后繼續(xù)給藥直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。刪除Gr-1~+的髓系細(xì)胞的方法為:在小鼠造模的前一天和后一天分別給小鼠腹腔注射250μg抗小鼠Gr-1單克隆抗體。結(jié)果:在自體血或者膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠中,MCC950減少了腦出血后腦內(nèi)IL-1β(白介素-1β)的產(chǎn)生,并減輕了腦出血所引起的神經(jīng)功能損傷和血腫周圍的腦水腫。在自體血誘導(dǎo)的腦出血小鼠中,MCC950減少了腦出血后腦組織的白細(xì)胞浸潤,同時(shí)減少了小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生。MCC950能夠減輕血腦屏障的破壞,減少細(xì)胞的死亡。而且,在刪除了小膠質(zhì)細(xì)胞或者Gr-1~+的髓系細(xì)胞以后,MCC950的保護(hù)作用消失。結(jié)論:以上研究結(jié)果說明選擇性NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950能夠減輕出血性損傷和神經(jīng)炎癥。NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950有潛力成為一種治療腦出血的選擇,有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
【圖文】：

MCC950減輕腦出血后腦損傷并改善長期預(yù)后通過向C57BL/6小鼠基底節(jié)區(qū)注射自體血或膠原酶來誘導(dǎo)腦出血模型

圖 2. MCC950 抑制 NLRP3 炎癥小體的激活和 IL-1β 的表達(dá)通過向 C57BL/6 小鼠尾狀核注射自體血誘導(dǎo)腦出血模型。腦出血模型誘導(dǎo)后，小鼠立即接受 MCC950（10 mg/kg）或相同體積溶劑腹腔注射，連續(xù) 3 天，每天一次。 3 天后，分別取 MCC950 組、溶劑組和假手術(shù)組小鼠腦組織提取 mRNA和蛋白。圖 A. 小鼠腦組織內(nèi)炎癥小體各組分和 IL-1β mRNA 的表達(dá)水平。B. 免疫印跡法分析各組小鼠腦組織 NLRP3、IL-1β、caspase-1 蛋白的表達(dá)情況。C. 圖中所示為各組小鼠 NLRP3、IL-1β、caspase-1 蛋白的表達(dá)水平。每組 n=6。所有數(shù)據(jù)由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，*P＜0.05，**P＜0.01。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R743.34

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本文編號：2701341