【摘要】：帕金森病(Parkinson Disease,PD)是第二大常見(jiàn)的神經(jīng)變性病,黑質(zhì)致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神經(jīng)元丟失是PD的病理特征。PD嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。PD在全球影響了65歲以上人群中1%人口。PD治療目前仍以藥物為主,但這些藥物只能改善或減輕患者臨床癥狀,不能延緩、阻止、甚至是逆轉(zhuǎn)PD的病程。所以尋找能減緩、阻止、逆轉(zhuǎn)PD患者病程的藥物對(duì)PD治療非常重要。研究證實(shí)PD中GSK-3β被激活,GSK-3β Ser9磷酸化(p-GSK-3β Ser9)水平降低——致α-synuclein表達(dá)增加和聚集形成包涵體并下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2和上調(diào)GSK-3β表達(dá),細(xì)胞最終死亡。SIRT2是NAD+依賴的組蛋白去乙�；�,主要位于胞漿。在PD模型中抑制SIRT2能減少α-synuclein數(shù)量、調(diào)節(jié)α-synuclein寡聚體大小、降低α-synuclein毒性;改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)能力、阻止紋狀體多巴胺(Dopamine,DA)和黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)陽(yáng)性(TH+)神經(jīng)元減少、提升還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平、降低Caspase-3活性等神經(jīng)保護(hù)作用。但是SIRT2的活性在PD模型中是否有變化,其活性是如何被調(diào)控的,尚未有報(bào)道,因此我們首次在PD細(xì)胞模型中研究SIRT2的活性是否被GSK3β調(diào)控以及是如何被GSK3β調(diào)控。首先建立6-羥基多巴(6-OHDA)的SH-SY5YPD細(xì)胞模型,確定1100μM 6-OHDA處理4h致細(xì)胞顯著死亡。接著我們用Western Blotting檢測(cè)到6-OHDA處理SH-SY5Y細(xì)胞和原代皮層神經(jīng)元中p-GSK-3β Ser9水平顯著降低,提示GSK-3β被激活;細(xì)胞內(nèi)SIRT2總表達(dá)水平未變化,但胞核內(nèi)SIRT2表達(dá)水平升高。接著我們利用免疫沉淀技術(shù)得到6-OHDA處理的SH-SY5Y細(xì)胞核內(nèi)SIRT2并檢測(cè)其活性,發(fā)現(xiàn)PD細(xì)胞模型胞核內(nèi)SIRT2活性顯著升高,而GSK-3β抑制劑SB216763能逆轉(zhuǎn)其活性升高。上述研究證實(shí)6-OHDA細(xì)胞模型中GSK-3β活性升高,雖未改變SIRT2表達(dá)水平,但胞核SIRT2表達(dá)及活性顯著升高。接著我們檢測(cè)GSK-3β是否磷酸化修飾SIRT2。我們構(gòu)建SIRT2帶GST(pGEX-4T-3)標(biāo)簽的質(zhì)粒,融合表達(dá)后與GST-Beads結(jié)合得到SIRT2純化蛋白,再用GSK-3β激酶和SIRT2、ATP、32P-y-ATP反應(yīng),進(jìn)行磷酸激酶實(shí)驗(yàn),反應(yīng)產(chǎn)物電泳后行放射自顯影檢測(cè)證實(shí)GSK-3β能磷酸化SIRT2,質(zhì)譜鑒定GSK-3β磷酸化SIRT2的具體位點(diǎn)為SIRT2 Ser327,331,335。再以GST-SIRT2質(zhì)粒為模板構(gòu)建GST-SIRT2S327A、GST-SIRT2S331A、GST-SIRT2S335A點(diǎn)突變質(zhì)粒,融合表達(dá)獲得蛋白。GSK-3β激酶體外磷酸化SIRT2點(diǎn)突變蛋白,放射自顯影檢測(cè)證實(shí)GSK-3β磷酸化SIRT2點(diǎn)突變蛋白水平明顯降低。證實(shí)GSK-3β能磷酸化修飾SIRT2,初步建立GSK-3β和SIRT2之間的聯(lián)系。過(guò)表達(dá)GSK-3β和SIRT2后免疫共沉淀結(jié)果提示其在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)能相互結(jié)合。在PD細(xì)胞模型中,免疫沉淀SIRT2后,Western Blotting檢測(cè)顯示SIRT2磷酸化水平顯著升高,GSK-3β抑制劑SB216763逆轉(zhuǎn)6-OHDA誘導(dǎo)的SIRT2磷酸化水平升高。在PD細(xì)胞模型中,6-OHDA致還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平顯著降低、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平顯著升高;SB216763和sh-RNA敲減SIRT2(sh-SIRT2)表達(dá)均能提升GSH和降低MDA水平。本研究發(fā)現(xiàn):1.PD細(xì)胞模型中GSK-3β活性增高;2.PD細(xì)胞模型內(nèi)總SIRT2水平未改變,但胞核內(nèi)SIRT2水平升高;SIRT2磷酸化水平顯著升高,其在細(xì)胞核內(nèi)活性升高;3.GSK-3β在6-OHDA細(xì)胞模型中磷酸化SIRT2,并促進(jìn)其在細(xì)胞核內(nèi)活性升高;4.6-OHDA細(xì)胞模型內(nèi),SIRT2活性升高,提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平而導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用。
【圖文】：

（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ＿ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿０１２２３７．３），然后將其邋ＣＤＳ邋區(qū)片段到逡逑ＮＥＢ網(wǎng)站（ｈｔｔｐ：／／ｎｃ２．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ＮＥＢｃｕｔｔｅｒ２／）查詢酶切位點(diǎn)，我們選擇不能酶切逡逑ＳＩＲＴ２片段的酶，然后再根據(jù)ｐＧＥＸ－４Ｔ－３上的多克隆位點(diǎn)（圖２），根據(jù)酶的酶逡逑切效率，最終選擇ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ作為雙酶切位點(diǎn)（即ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ是ｐＧＥＸ－４Ｔ－３逡逑上的酶切位點(diǎn)，而不能酶切ＳＩＲＴ２的ＣＤＳ區(qū)片段）。逡逑１５逡逑

邐６－ＯＨＤＡ邐６－ＯＨ邋Ｄ邋Ａ＋ＳＢ２１６７６３逡逑圖７．邋ＳＢ２１６７６３逆轉(zhuǎn)ＰＤ細(xì)胞模型細(xì)胞核內(nèi)ＳＩＲＴ２活性升高逡逑Ｆｉｇ．７邋ＳＢ２１６７６３邋ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｔｈｅ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ａｆｔｅｒ邋６－ＯＨＤＡ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｎｕｃｌｅａｒ．Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＳＩＲＴ２邋ｗａｓ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃｅｎｔｌｙ邋ａｎｄ邋ＳＢ２１６７６３邋ｒｅｖｅｒｓｅｄ邋ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ逡逑ａｆｔｅｒ邋６－ＯＨＤＡ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＳＨ－ＳＹ５Ｙ邋ｃｅｌｌｓ．Ａｌｌ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｒｅｅ邋ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ．逡逑Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ｗｅｒｅ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ土ＳＤ．邋★／？＜０．０５，邋＊★／？＜０．０】．逡逑八、ＧＳＫ－３Ｐ在體外可磷酸化ＳＩＲＴ２逡逑通過(guò)前面ＳＩＲＴ２活性檢測(cè)結(jié)果顯示ＰＤ細(xì)胞模型內(nèi)ＳＩＲＴ２活性增高，而逡逑ＧＳＫ－３Ｐ抑制劑ＳＢ２１６７６３能逆轉(zhuǎn)ＳＩＲＴ２活性的升高。所以我們想知道ＧＳＫ－３Ｐ是逡逑如何調(diào)節(jié)ＳＩＲＴ２活性的呢？也即是通過(guò)哪種修飾方式來(lái)調(diào)節(jié)ＳＩＲＴ２活性的呢？逡逑通過(guò)ＧＰＳ３．０軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ＧＳＫ－３｜３可磷酸化ＳＩＲＴ２。是否ＧＳＫ－邛是通過(guò)磷逡逑酸化ＳＩＲＴ２來(lái)調(diào)節(jié)ＳＩＲＴ２活性？所以我們想通過(guò)體外磷酸化反應(yīng)后行放射自顯逡逑影檢測(cè)，明確ＧＳＫ－３Ｐ是否能磷酸化ＳＩＲＴ２，最后通過(guò)質(zhì)譜來(lái)鑒定ＧＳＫ－３Ｐ磷酸化逡逑ＳＩＲＴ２的具體氨基酸殘基位點(diǎn)。為了進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)，我們需要得到純化的逡逑ＳＩＲＴ２蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R742.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周志華;GSK-3β-SIRT2通路在6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病神經(jīng)元死亡中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2019年

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本文編號(hào)：2701231