【摘要】：目的:1.利用2條特異性的、高親和力的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤核酸適體的形成多價(jià)核酸適體探針,增強(qiáng)對(duì)靶標(biāo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的識(shí)別靈敏度。2.篩選獲得針對(duì)人腦膠質(zhì)瘤分泌的外泌體的高親和力、高特異性的核酸適體,作為一種新型分子探針用于甄定和分選膠質(zhì)瘤外泌體。方法:1.利用本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)Cell-SELEX技術(shù)篩選獲得的2條膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G的核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a,利用流式細(xì)胞儀鑒定兩條核酸適體的協(xié)同作用,通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡證明核酸適體對(duì)在靶標(biāo)細(xì)胞膜上的共定位作用。同時(shí)在血清、腦脊液中檢測(cè)核酸適體在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性及結(jié)合能力,進(jìn)一步考察其實(shí)際應(yīng)用。2.通過(guò)差速離心法,分離純化人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44分泌的外泌體,利用流式細(xì)胞儀和透射電鏡驗(yàn)證其生物學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。利用之前本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)CellSELEX技術(shù)篩選獲得的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44的核酸適體文庫(kù),以流式細(xì)胞儀分析并篩選得到對(duì)SHG44外泌體結(jié)合能力最強(qiáng)的核酸適體。通過(guò)軟件模擬其二級(jí)結(jié)構(gòu),在保留主要莖環(huán)結(jié)構(gòu)的情況下對(duì)其進(jìn)行截短優(yōu)化。選擇其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的外泌體,以流式細(xì)胞儀分析核酸適體的選擇性。在血清、腦脊液中檢測(cè)核酸適體在生理環(huán)境中的結(jié)合力,進(jìn)一步考察其實(shí)際應(yīng)用。通過(guò)胰酶消化實(shí)驗(yàn)核酸適體的靶標(biāo)性質(zhì),并通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)其結(jié)合的靶標(biāo)。結(jié)果:1.核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a之間存在協(xié)同作用,同時(shí)結(jié)合于T98G細(xì)胞膜上。激光共聚焦可見(jiàn)核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a在細(xì)胞膜上部分重疊。在血清、腦脊液中穩(wěn)定性良好,并且能在血清、腦脊液中對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞保持良好的結(jié)合能力和特異性。2.通過(guò)差速離心法分離純化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44產(chǎn)生的外泌體,在電鏡下呈現(xiàn)磷脂雙分子層囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑在40-100nm范圍內(nèi)。流式細(xì)胞儀可見(jiàn)外泌體特異性蛋白標(biāo)志物CD63呈陽(yáng)性表達(dá)。以流式細(xì)胞技術(shù)分析人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44核酸適體文庫(kù),其中核酸適體S12親和力和特異性均最佳。通過(guò)模擬核酸適體二級(jí)結(jié)構(gòu),在保留主要莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前提下對(duì)其截短優(yōu)化。37℃條件下,截短的核酸適體S12-4在血清、腦脊液等生理環(huán)境中對(duì)靶標(biāo)依然保持良好的結(jié)合能力和特異性。與預(yù)先經(jīng)過(guò)胰酶處理的外泌體孵育,S12-4喪失原有的結(jié)合能力。利用修飾了Biotin的核酸適體來(lái)初步甄定人膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44外泌體表面的生物標(biāo)志物。結(jié)論:1.核酸適體WYZ-41a、WYZ-50a存在協(xié)同作用,并且共定位于細(xì)胞膜上,在生理環(huán)境下的穩(wěn)定性和對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合能力良好,可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種新型分子探針,將在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的早期診斷、術(shù)中熒光、監(jiān)測(cè)預(yù)后、生物標(biāo)志物甄定等方面發(fā)揮重要作用。2.篩選獲得的膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44外泌體特異性核酸適體S12-4能夠區(qū)分膠質(zhì)瘤細(xì)胞SHG44外泌體與其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞系外泌體,可以作為外泌體分選探針。并且能在生理環(huán)境下依然保持其生理活性。經(jīng)過(guò)胰酶消化實(shí)驗(yàn)證明核酸適體S12-4結(jié)合的靶標(biāo)為蛋白類物質(zhì),初步甄定得到的生物標(biāo)志物為熱休克蛋白70(HSC70),有望在腦膠質(zhì)瘤早期診斷和腫瘤預(yù)后評(píng)估等領(lǐng)域發(fā)揮獨(dú)特作用。
【圖文】：

加入 300 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞保持單測(cè)各組細(xì)胞與核酸適體結(jié)合后的熒光值。以 Cy5每管分別計(jì)數(shù) 10000 個(gè)細(xì)胞，每組重復(fù)三遍。結(jié)果與分析適體 WYZ-41a、WYZ-50a 的協(xié)同作用核酸適體解離常數(shù)（dissociation constant, Kd）， 達(dá)到平臺(tái)值，，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)從 100 nM 增加到 200 nM 時(shí)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯酸適體 WYZ-50a 在細(xì)胞表面已經(jīng)達(dá)到飽和。同 和 100 nM WYZ-41a 的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō) 結(jié)合于靶標(biāo)細(xì)胞 T98G 上的不同靶點(diǎn)，可以形成 T98G 的識(shí)別能力。

13圖 1.2 激光共聚焦熒光顯微鏡細(xì)胞成像。Cy5 熒光基團(tuán)標(biāo)記的 WYZ-41a 和 FITC熒光基團(tuán)標(biāo)記的 WYZ-50a 分別或共同與靶標(biāo)細(xì)胞 T98G 和腦正常星形細(xì)胞SVGp12 結(jié)合。以同樣帶有兩種熒光基團(tuán)的隨機(jī)序列作為對(duì)照。Hochest 染細(xì)胞核，核酸適體終濃度 400nM。Fig. 1.2 Fluorescence confocal images of T98G and SVGp12 cells incubated with Cy5-labeled aptamer WYZ-41a and FITC-labeled aptamer WYZ-50a. Fraction of initialLibrary labeled with Cy5 and FITC, which did not bind to T98G cells, were used ascontrol. Column 1 is the Hochest channel, column 2 is the Cy5 channel, column 3 is theFITC channel and column 4 is the overlay of the Cy5 and FITC channels. Cells in row 1,3 were incubated with Initial Library-FITC (control) and Initial Library-Cy5 (control).Cells in row 2, 4 were incubated with aptamer WYZ-41a-Cy5 and aptamer WYZ-50a-FITC. The final concentration of WYZ-41a, WYZ-50a and initial library was 400 nM.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李詠梅;趙慶歡;;核酸適配體修飾的納米脂質(zhì)體的制備及靶向毒性研究[J];化學(xué)與生物工程;2015年08期

本文編號(hào)：2701150