【摘要】：惡性膠質瘤(Malignant Glioma)是一種較為常見且致命的腦部腫瘤,其往往又預示著患者高發(fā)病率以及高死亡率。膠質母細胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一種較常見的原發(fā)性惡性膠質瘤,其預后不良。在過去的十年內并沒有更為有效的治療方法出現。結合現今的醫(yī)療手段,包括外科手術治療以及放射治療和化學藥物治療的應用,患者診斷后的生存期望也僅有14個月左右。膠質瘤的基因表達或大或小的改變,引起了調控細胞增殖、細胞凋亡、血管生成以及轉移侵襲的相關調控基因表達的改變。然而,具體的由調控基因改變引起的細胞增殖和細胞凋亡異常的分子機制至今尚不明確。因此,詳盡分析這些變化的調控基因可為膠質瘤患者的診斷、預后以及臨床治療提供新的靶標。砷素拮抗蛋白-2(Arsenic-resistance protein-2,Ars2)是由人類的SRRT基因編碼的核蛋白。其c DNA的部分片段首次克隆于倉鼠細胞系,當時的研究認為Ars2是一種可以拮抗砷鹽毒性的蛋白。后續(xù)研究發(fā)現,Ars2也是一個RNA沉默誘導機制的影響因子,在果蠅中其與抗病毒能力相關,在哺乳動物中則認為其與細胞增殖調控相關。通過多年的研究總結發(fā)現,Ars2蛋白的部分區(qū)段與拮抗砷鹽毒性相關,而其全長蛋白則通過調控RNA代謝調節(jié)細胞增殖。同時Ars2也被認為是核內帽式結構復合體CBC(Nuclear Cap-binding Complex)的組分之一,與mi R-155、mi R-21以及l(fā)et-7的生物學合成相關,并以此調控細胞增殖。也就是說,Ars2的敲降可有效的下調一些micro RNA(mi RNA)的表達。最近,學者發(fā)現Ars2在人類的肝癌(Human Hepatocellular Carcinoma,HCC)和膽管細胞癌(Cholangiocarcinoma)中高表達,并且研究認為其可以作為臨床的診斷或預后指標,甚至是治療靶標。然而卻沒有直接的證據指出,Ars2在膠質瘤中發(fā)揮類似的作用。在本文的研究中我們發(fā)現Ars2在調控膠質瘤細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用,并且影響了其在體內的成瘤能力。功能研究發(fā)現,Ars2的敲降會引起mi RNA-6798-3p的表達下調,進而導致p53和p21表達上調,最終引起細胞凋亡。這些發(fā)現都將為膠質瘤患者的臨床治療提供新視野。本研究獲得的主要研究結果如下:1.Ars2高表達與患者不良預后相關為確定Ars2是否可以成為膠質瘤患者的預后指標,研究前期我們通過查詢網絡數據平臺R2,利用Kaplan-Meier分析方法對Frence數據庫的膠質瘤患者進行預后評估。結果表明,Ars2高表達患者(78例)的3年存活率為10%,而Ars2低表達患者(195例)的3年生存率為39%;Ars2高表達患者的5年存活率為6%,而Ars2低表達患者的5年生存率為28%。同時我們也發(fā)現Ars2高表達于膠質瘤細胞系(U87,LN229,A172,U118,U251),而低表達于正常人腦星形膠質細胞(normal human astrocytes,HA)。也就是說Ars2普遍表達于膠質瘤細胞,而并非是某一種膠質瘤的特例。以上結果表明,在膠質瘤患者中,Ars2的高表達與病人的不良預后相關。我們推測或許Ars2可以作為膠質瘤治療的新靶點。2.Ars2通過調控p53/p21信號通路調控膠質瘤細胞凋亡進一步研究發(fā)現,在膠質瘤細胞系U87和LN229中,Ars2的敲降誘導細胞凋亡發(fā)生。隨后我們又利用Western Blot分析法檢測Ars2敲降后p53及其下游的p21蛋白的表達情況,筆者發(fā)現p53與p21的蛋白表達量顯著增強。此外,利用含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)抑制劑(z-VAD-fmk)處理Ars2敲降的細胞后,細胞凋亡受到明顯抑制。也就是說Ars2敲低誘導的細胞凋亡是通過caspase路徑實現的。為排除脫靶效應,筆者在Ars2敲低的細胞系中過表達Ars2并檢測其對Ars2敲低誘導的細胞凋亡的影響,結果顯示在Ars2敲降的細胞系中過表達Ars2可抑制細胞因Ars2敲降誘導的細胞凋亡。同時利用si RNA對敲降Ars2細胞中的p53以及p21進行特異性的干擾,結果進一步證明,Ars2的敲降誘導p53/p21依賴的細胞凋亡的發(fā)生。3.Ars2通過mi RNA-6798-3p調控膠質瘤細胞凋亡據報道,Ars2在mi RNA的生物學合成過程中發(fā)揮著重要的作用。所以在后續(xù)的研究過程中,我們利用了廣州銳博公司提供的高通量mi RNA芯片,比較sh Con-U87與sh Ars2-1#-U87細胞中的mi RNA的表達情況,篩選其中表達下調倍數大于2的mi RNA。隨后我們得到了25個表達下調的mi RNA。同時利用mi RNA的q RT-PCR技術我們確定了mi RNA-6798-3p在U87和LN229敲降Ars2后表達下調。為了進一步驗證mi RNA-6798-3p是否參與到Ars2敲低誘導的U87和LN229細胞凋亡的過程中。我們利用mi RNA-6798-3p人工合成產物mi RNA-6798-3p mimic以及流式細胞術(Flow Cytometry)檢測mi RNA-6798-3p對Ars2敲低誘導的細胞凋亡的影響。結果顯示,共轉染mi RNA-6798-3p mimic以及sh Ars2后可以抑制由Ars2敲低誘導的U87和LN229細胞凋亡。Western Blot結果也顯示共轉染兩者可逆轉因Ars2敲低導致的p53、p21以及激活/剪切態(tài)含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(actibation/cleaved-caspase3,C-Caspase3)蛋白表達的上調。以上結果表明,Ars2通過調控mi RNA-6798-3p調控膠質瘤細胞凋亡。4.Ars2對膠質瘤細胞原位腫瘤形成能力的影響為驗證Ars2的敲低是否在體內可抑制膠質瘤細胞增殖,我們構建了NOD/SCID鼠原位移植瘤模型。研究發(fā)現,通過等量原位注射U87-sh Con以及U87-sh Ars2-1#細胞,對應荷瘤鼠在注射細胞后的存活時間分別為42.2±3.9天和82.2±16.5天,且具有顯著性差異。同時我們也發(fā)現,注射sh Con細胞的NOD/SCID鼠的腦部腫瘤占據了將近整個的右半球,而在sh Ars2-1#介入之后腦部腫瘤變得幾乎不可見。為進一步的研究Ars2敲低后引起的病理學變化,通過HE染色技術,我們發(fā)現注射sh Con-U87細胞的NOD/SCID鼠的腦部切片中存在大量的腫瘤細胞,相反的注射了sh Ars2-1#-U87細胞的NOD/SCID鼠的腦部切片中幾乎觀測不到腫瘤細胞。隨后我們利用免疫組化染色法對NOD/SCID鼠的大腦進行特異性染色,發(fā)現在注射sh Con-U87細胞后NOD/SCID鼠的大腦有明顯的Ki-67信號,然而在Ars2敲低組內NOD/SCID鼠大腦內的表達Ki-67的細胞較少。為了進一步確定Ars2的敲低是否成功,我們同樣的利用免疫組化的方法對Ars2的表達進行檢測。結果顯示,Ars2陽性細胞在sh Ars2-1#組的小鼠大腦切片內要明顯少于sh Con組。綜上所述,Ars2可以影響膠質瘤細胞的體內成瘤能力。除此之外,本人還開展了麥冬皂苷D(Ophiopogonin D,OP-D)對乳腺癌細胞自噬調控的研究,并獲得如下實驗結果:5.OP-D可誘導乳腺癌細胞自噬降解抑制OP-D是一種甾體糖苷,提取自百合科植物麥冬,近些年來的研究發(fā)現,OP-D可以靶定多條通路進而抑制肺癌細胞增殖。在本文中我們發(fā)現通過轉染綠色熒光質粒EGFP-LC3,經藥物處理后,細胞內發(fā)現大量的熒光團。利用Western blot檢測細胞自噬相關調控蛋白SQSTM1、LC3B、LAMP1以及BECN1的表達水平,結果顯示,SQSTM1、LC3B-II以及LAMP1會隨著OP-D濃度以及作用時間的累積而增強,而BECN1的表達卻沒有變化。同時共處理細胞自噬降解抑制劑Bafilomycin A1(Baf)和細胞自噬激動劑Rapamycin(Rapa)結果顯示,OP-D的作用與Baf作用類似。也就是說OP-D抑制了乳腺癌細胞自噬降解過程。6.OP-D可以通過抑制微管蛋白α-Tubulin乙酰化進而抑制細胞自噬降解根據EGFP-LC3轉染結果顯示,OP-D處理乳腺癌細胞后,細胞內的自噬體呈現分散狀態(tài)而非聚集狀態(tài),我們推測細胞微管蛋白α-Tubulin發(fā)生變化。通過Western blot分析法我們確定α-Tubulin的乙�；茏琛Ｒ簿褪钦fOP-D是通過抑制微管蛋白乙�；M而抑制了乳腺癌細胞自噬降解。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.4

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