【摘要】：背景神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的,可引起患者長(zhǎng)時(shí)間的痛苦,降低患者的生活質(zhì)量,其臨床特征為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛等。目前我們對(duì)神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展的分子機(jī)制并不十分清楚,臨床上依然缺少有效的治療手段,因此深入研究疼痛及鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制,將增加對(duì)疼痛本身的認(rèn)識(shí),對(duì)于新型鎮(zhèn)痛藥的研發(fā),具有重要的理論和臨床意義。鉀離子通道是亞型最多、家族最為多樣化的一類離子通道,研究證明背根神經(jīng)節(jié)的電壓門控鉀離子通道是決定神經(jīng)元放電頻率和峰電位持續(xù)時(shí)間的關(guān)鍵因素。Kv1.2屬于Kv1通透型亞型,在背根神經(jīng)節(jié)中大量表達(dá)。周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型中,背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元Kv1.2蛋白表達(dá)減少,電流下降,興奮性增加,并出現(xiàn)疼痛。有關(guān)表觀遺傳修飾參與疼痛的研究越來越受到人們的關(guān)注。表觀遺傳指的是不改變基因組DNA的情況下,發(fā)生的一種可遺傳修飾。組蛋白乙�；揎検瞧渲幸环N重要的方式,主要由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)與組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)進(jìn)行調(diào)節(jié),二者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表觀遺傳學(xué)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。HAT促使染色體的解聚,激活轉(zhuǎn)錄;而HDACs則封閉DNA,進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄過程。有研究表明,組蛋白乙�；瘏⑴c到了突觸可塑性和慢性疼痛中,且組蛋白去乙酰化酶抑制劑在緩解炎癥誘發(fā)的疼痛,內(nèi)臟疼痛中也有著重要的調(diào)控作用。而去乙�；敢种苿㏒AHA可以緩解大鼠神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)病理性疼痛,但HDAC的參與機(jī)制尚不清楚。因此,本研究建立了坐骨神經(jīng)壓榨性損傷模型(Chronic constriction injury,CCI),研究去乙�；概cKv1.2基因的表達(dá)之間的關(guān)系,為臨床更具針對(duì)性的藥物研發(fā)提供新思路。目的本實(shí)驗(yàn)建立CCI大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型,檢測(cè)術(shù)后大鼠的行為學(xué)變化以及HDAC1和HDAC2在術(shù)后0,3,7,14天的表達(dá)變化;通過給予去乙�；敢种苿㏒AHA,發(fā)現(xiàn)大鼠行為學(xué)的改變以及Kv1.2的表達(dá)變化,驗(yàn)證去乙�；甘欠衽cKv1.2存在聯(lián)系;通過免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)HDAC1,HDAC2,Kv1.2在脊髓和DRG中表達(dá)部位以及HDAC1,HDAC2分別與Kv1.2的雙標(biāo)情況;接著利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,檢測(cè)對(duì)Kv1.2的表達(dá)有哪些影響,最后在體鞘內(nèi)注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,檢測(cè)行為學(xué)變化以及Kv1.2的表達(dá)變化,由此來進(jìn)一步驗(yàn)證HDAC1或HDAC2對(duì)Kv1.2的調(diào)控作用。方法1.CCI模型建立及去乙�；窰DAC1,HDAC2的表達(dá)情況。大鼠麻醉,用碘伏消毒左側(cè)后肢,暴露出大鼠左側(cè)大腿中上1/3部位坐骨神經(jīng)干,用玻璃分針游離出神經(jīng),用4-0手術(shù)絲線環(huán)繞神經(jīng)干分別做4個(gè)輕度結(jié)扎環(huán),間距大約1 mm。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎,其他步驟同手術(shù)組。分別檢測(cè)兩組術(shù)前1天,術(shù)后3天,5天,7天,14天的機(jī)械痛閾和熱痛閾。并通過Western blot,qPCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)術(shù)后0,3,7,14天HDAC1,HDAC2的蛋白表達(dá)及mRNA的表達(dá)變化。通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HDAC1,HDAC2在DRG和脊髓的分布情況。2.給予去乙�；敢种苿㏒AHA觀察行為學(xué)變化以及Kv1.2的表達(dá)。雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,CCI+vehicle,CCI+0.05μg/μL SAHA,CCI+0.1μg/μL SAHA,CCI+0.2μg/μL SAHA。在CCI后7天進(jìn)行鞘內(nèi)注射,連續(xù)給藥7天,并在術(shù)前1天,術(shù)后3,5,7,8,9,10,11,12,13,14天進(jìn)行機(jī)械痛閾和熱痛閾的檢測(cè)。取大鼠腰膨大區(qū)脊髓及術(shù)側(cè)L_4-L_6的背根神經(jīng)節(jié),通過Western blot技術(shù)檢測(cè)Kv1.2蛋白的變化。通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Kv1.2在DRG分別與HDAC1,HDAC2的共標(biāo)情況。3.鞘內(nèi)注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,檢測(cè)痛行為及Kv1.2表達(dá)情況。首先在PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA,并通過Western blot檢測(cè)Kv1.2的表達(dá)。隨后大鼠鞘內(nèi)置管,待恢復(fù)進(jìn)行CCI模型制作。手術(shù)分為5組:CCI,CCI+HDAC1 NC,CCI+HDAC1 siRNA,CCI+HDAC2 NC,CCI+HDAC2 siRNA。于術(shù)后7天注射相應(yīng)的siRNA,并檢測(cè)術(shù)后0,3,5,7,8,9,10,11,12天的行為學(xué)變化。取脊髓和DRG,通過Western blot檢測(cè)Kv1.2的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果1.在CCI誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)病理痛模型中,HDAC1和HDAC2在DRG表達(dá)升高。CCI手術(shù)后,與sham組大鼠相比,手術(shù)組大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾在術(shù)后3d-14d顯著降低(P0.001),但對(duì)側(cè)機(jī)械痛閾和熱痛閾與sham組相比沒有顯著差異,說明模型建立成功。之后通過Western blot檢測(cè)脊髓HDAC1表達(dá)沒有明顯變化,而HDAC2表達(dá)在術(shù)后7,14天均有明顯的上調(diào)(P0.05)。但是在背根神經(jīng)節(jié)DRG,HDAC1在術(shù)后3,7,14天表達(dá)均顯著上升(P0.01),HDAC2的表達(dá)也在術(shù)后7,14天升高(P0.01)。通過qPCR檢測(cè)兩者mRAN水平的表達(dá),與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。通過免疫熒光技術(shù),發(fā)現(xiàn)HDAC1在脊髓主要表達(dá)在膠質(zhì)細(xì)胞,在神經(jīng)元的表達(dá)量很少。在DRG,HDAC1也僅僅表達(dá)在外圍膠質(zhì)細(xì)胞和少部分的中小型神經(jīng)元中。而HDAC2在脊髓主要與神經(jīng)元共標(biāo),在DRG,主要與大神經(jīng)元共標(biāo),與中小神經(jīng)元也有少量共標(biāo)。2.鞘內(nèi)注射去乙酰化酶抑制劑SAHA緩解大鼠痛敏,并反轉(zhuǎn)了術(shù)后Kv1.2的下調(diào)。大鼠鞘內(nèi)注射去乙�；敢种苿㏒AHA,發(fā)現(xiàn)0.1μg/μL SAHA,0.2μg/μL SAHA可以顯著緩解大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏。并且于術(shù)后14天取材,通過Western blot檢測(cè)給藥后脊髓和DRG中Kv1.2的蛋白表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)無論是脊髓還是DRG,CCI后Kv1.2表達(dá)降低(P0.01),而給予SAHA后,Kv1.2表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)(P0.05)。通過免疫熒光雙標(biāo)技術(shù),Kv1.2在DRG中同樣主要表達(dá)在大神經(jīng)元中,在中小神經(jīng)元中的表達(dá)較少,而不與膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)。進(jìn)一步雙標(biāo)發(fā)現(xiàn),HDAC1不與Kv1.2共標(biāo),而HDAC2則基本與Kv1.2全部共標(biāo)。3.鞘內(nèi)注射HDAC2 siRNA緩解大鼠痛敏并增強(qiáng)Kv1.2的表達(dá)。體外試驗(yàn)中,將HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中,從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)檢測(cè)Kv1.2表達(dá),發(fā)現(xiàn)只有HDAC2 siRNA可以使Kv1.2的表達(dá)上調(diào)(P0.05)。體內(nèi)試驗(yàn)中,鞘內(nèi)注射HDAC1 siRNA和HDAC2 siRNA后,測(cè)試機(jī)械閾值和熱閾值。結(jié)果顯示與CCI組相比,注射HDAC2 siRNA顯著增加了大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾(P0.05)。對(duì)側(cè)機(jī)械痛閾和熱痛閾沒有顯著差異。Western blot結(jié)果顯示,相比CCI組,大鼠鞘內(nèi)注射HDAC2 siRNA后,DRGs和脊髓中的Kv1.2蛋白水平顯著增加(P0.05)。鞘內(nèi)注射NC(陰性對(duì)照)組對(duì)Kv1.2水平?jīng)]有影響。而注射HDAC1 siRNA后行為學(xué)及Kv1.2表達(dá)沒有顯著變化。結(jié)論在CCI模型大鼠DRG中,去乙�；窰DAC2表達(dá)升高,沉默HDAC2可以逆轉(zhuǎn)由CCI引起的Kv1.2的低表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李文遷;俞衛(wèi)鋒;;慢性病理性疼痛的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2016年02期

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本文編號(hào)：2691425