【摘要】：在中國,腦卒中發(fā)病率高、復發(fā)率高、致死致殘率高,已躍升為我國國民死因首位。根據(jù)全國范圍內(nèi)的人口調(diào)查,中國每年大約有240萬新增腦卒中病例,每年110萬與腦卒中相關的死亡,因此給國家和個人帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。其中缺血性腦卒中也被稱為腦梗死,占所有腦卒中病例的87%,它主要是因為顱內(nèi)動脈的阻塞或狹窄導致血流中斷所致。缺血性腦卒中的最重要病理生理機制是血管壁脂質(zhì)的沉積、炎癥因子的激活等一些原因?qū)е碌膭用}粥樣硬化。TPA(tissue-type plasminogen activator,組織型纖溶酶原激活劑)溶栓是缺血性腦卒中常用的有效治療方法,但多數(shù)患者因未能在相應的時間窗內(nèi)到達醫(yī)院而失去此治療的機會,從而導致永久的神經(jīng)功能缺損。根據(jù)中國國民卒中登記統(tǒng)計顯示,21.5%的急性缺血性腦卒中患者在發(fā)病3小時內(nèi)趕到急診科,12.6%有資格接受溶栓治療,但只有1.6%接受了TPA靜脈給藥。因此,明確缺血性腦卒中動脈粥樣硬化的產(chǎn)生機制,對預防缺血性腦卒中的發(fā)生及腦卒中發(fā)生后的治療至關重要。然而動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的基本機制復雜,學術界存在許多學說,包括炎癥反應學說、脂質(zhì)浸潤學說、氧化應激學說、血栓形成學說、遺傳學說和基因蛋白組學說等。其中以前兩種學說得到廣泛認可與接受。近十幾年間,越來越多的研究證明微生物尤其是腸道微生物參與了動脈粥樣硬化的過程。多篇流行病學研究發(fā)現(xiàn)微生物包括肺炎衣原體、幽門螺桿菌和牙齦卟啉單胞菌與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關。通過基因技術已在不同的患者身上,證實了人類動脈粥樣硬化斑塊中存在細菌DNA。其后的臨床試驗中發(fā)現(xiàn)微生物群與多種疾病的產(chǎn)生密切相關包括肥胖癥、2型糖尿病和心血管疾病。人類與這些微生物共同進化以共生方式相處。微生物有許多生理作用包括產(chǎn)生必需維生素(如維生素B和維生素K)、參與碳水化合物的消化、免疫系統(tǒng)的建立、調(diào)節(jié)代謝包括膽固醇和脂質(zhì)代謝以及產(chǎn)生信號分子如包括短鏈脂肪酸和二級膽汁酸。與此同時微生物群在包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的許多疾病中都發(fā)揮著重要作用。多項研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道的微生物群可通過神經(jīng)、免疫以及直接體液信號傳導途徑與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生強烈的信號傳遞,中樞神經(jīng)系統(tǒng)也可以通過調(diào)節(jié)腸道運動和分泌來改變腸道微環(huán)境,因此被稱為雙向腦腸信號,也就是今天我們所悉知的“腦腸軸理論”。動物和人類研究表明腸道微生物群參與自閉癥、自身免疫性腦脊髓炎、視神經(jīng)脊髓炎和帕金森的發(fā)病過程。腸道微生物群是否與急性缺血性腦卒中發(fā)病機制或某些危險因素相關?上述假設可進一步闡述腦腸軸的理論,也可為急性缺血性腦卒中的預防和治療提供理論依據(jù)。國外已有一些動物實驗研究發(fā)現(xiàn)腦卒中動物模型中腸道微生物群組成的變化。Tascillar等人報道在小鼠大腦中動脈閉塞模型中發(fā)現(xiàn)腸道細菌移位至腸外。Swidsinski等觀察到在實驗動物急性腦損傷后可出現(xiàn)短暫的結腸炎癥和數(shù)個腸道細菌群的消失。但是,罕有關于腸道微生物群與急性缺血性腦卒中臨床相關性的研究。因此腸道微生物群參與急性缺血性腦卒中發(fā)病的確切機制值得我們進一步探討。為了探索這一機制,本課題經(jīng)過嚴格的入排標準,選取了40例受試者(其中試驗組為31例急性缺血性腦卒中患者,對照組為9例相同年齡段的健康對照組),通過糞便16S rRNA基因測序,以檢測兩組腸道微生物組成的差異,并用線性回歸分析法和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因組百科全書)分析法探討腸道菌群與急性缺血性腦卒中危險因素的相關性。本研究主要獲得如下結果:1.急性缺血性腦卒中患者組和健康對照組腸道菌群的多樣性無明顯差異在這項研究中,從31名急性缺血性腦卒中患者和9名健康對照者中收集了總共40份血液樣本和糞便樣本。兩組的臨床基本特征顯示,急性缺血性腦卒中患者的WBC(white blood cell,白細胞)、TC(total cholesterol,總膽固醇)、TG(triglyceride,甘油三酯)和LP(a)(Lipoprotein(a),脂蛋白(a))水平顯著高于健康對照組,而HDL(high density lipoprotein,高密度脂蛋白)顯著低于健康對照組。另外腦卒中組中吸煙率、高血壓率明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。然而,微生物群落的物種總體豐富度、均勻度無統(tǒng)計學差異,表明兩組腸道菌群的多樣性沒有顯著性差異。2.急性缺血性腦卒中患者和健康對照組的腸道細菌的種類存在統(tǒng)計學差異進一步,我們對腸道微生物群的不同分類群豐度(門,綱,目,科,屬和種)進行分析發(fā)現(xiàn)。在腸道細菌的種水平中,急性缺血性腦卒中患者和健康對照之間存在顯著性差異。存在差異的三種腸道細菌分別是Blautia obeum,Streptococcus infantis和Prevotella copri。與健康對照組相比,患者組中Blautia obeum的豐度較低,而Streptococcus infantis和Prevotella copri豐度較高,差異存在統(tǒng)計學意義。3.異常表達的三種腸道細菌與急性缺血性腦卒中的危險因素相關在確定了三種異常表達的腸道微生物群后,我們采用線性回歸分析了腸道細菌與危險因素之間是否存在相關性。Blautia obeum與WBC呈負相關,Streptococcus infantis和LP(a)呈正相關。為了預測糞便中微生物群落的基因家族和相關功能途徑的豐富性,基于16S rRNA基因測序和Green基因數(shù)據(jù)庫,進行了一種預測代謝方法KEGG功能途徑分析。結果表明,急性缺血性腦卒中患者中許多細菌通路如脂多糖代謝、分泌功能和鞭毛裝配均受到明顯的調(diào)節(jié)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦卒中患者組中有三種異常表達的細菌——Blautia obeum、Streptococcus infantis和Prevotella copri。這三種細菌可能與急性缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展存在相關性,因為它們與缺血性腦卒中的危險因素和多種功能代謝途徑有關。這些提示改變的腸道細菌可能參與了缺血腦卒中的發(fā)病過程,有望可以成為治療腦血管疾病及代謝疾病的潛在靶點。
【圖文】：

總體工作流程圖

南京醫(yī)科大學博士學位論文17圖2： Amplicon測序信息分析流程4.統(tǒng)計學分析用R軟件（v3.1.1）繪制的分析表或柱狀圖總結了樣本中每個分類等級（種）或OUT（可操作分類單元）。采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗方法對QIIME中不同組間的OTU進行了識別。在QIIME中未報告的差異，，將QIIME分析中的p<0.1的OUT:s設定為通用水平，然后使用Graphpad prim6進行統(tǒng)計檢驗。采用SPSS對分類變量進行卡方檢驗。組間比較p<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3

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本文編號：2683163