【摘要】：目的:全腦的缺血再灌注損傷是嚴重危害人類健康的常見急癥。以心臟停跳復蘇后的全腦缺血再灌注為例,全腦的缺血再灌注損傷患者的最終存活率大約只有12%,存活者中具有良好神經功能的患者少于5%。亞低溫治療是目前唯一在臨床上被證實的在心臟停跳恢復自主循環(huán)后能有效提高生存率和改善神經系統(tǒng)預后的治療方式。但是在亞低溫治療中,亞低溫起始時間和持續(xù)時間的選擇對于提高治療效果十分重要,明確最佳亞低溫起始時間和持續(xù)時間的作用與機制意義重大。Calpain是非溶酶體中性半胱氨酸蛋白水解酶家族中的成員,其活動依賴于鈣,并受特異性內源性抑制物鈣蛋白酶抑素的調節(jié)。目前報告的calpain共有11種亞型,在腦組織中最豐富最具特征的的亞型為μ-calpain和m-calpain。Bendarski的研究表明,μ-calpain在腦缺血后calpain調節(jié)腦組織的病理生理過程中發(fā)揮主要作用。Liebetrau等人發(fā)現(xiàn),亞低溫能夠減少腦缺血再灌注后calpain的活動及其引起的蛋白水解,這一研究提示抑制calpain的活動,能夠保護腦缺血再灌注后的神經元。而在體內還需要進一步研究m-calpain和μ-calpain在腦缺血再灌注損傷的作用。鎂離子具有多種功效,它是天門冬氨酸(NMDA)受體和鈣離子的拮抗劑,又是血管擴張劑,而且多種腦損傷動物實驗證實硫酸鎂對血腦屏障還具有保護作用。Miles等人通過靜脈輸入硫酸鎂抑制了短暫前腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)神經元的凋亡,而Zhu等人發(fā)現(xiàn)靜脈輸入硫酸鎂與亞低溫治療相結合能進一步減少短暫全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經元的凋亡。但是仍需要檢驗亞低溫治療結合靜脈輸入硫酸鎂對心跳驟停后全腦缺血再灌注的神經保護效果,為臨床醫(yī)療提供新的思路及理論支持。研究方法:1.采用雄性成年Long Evans大鼠建立10min窒息心臟停跳心肺復蘇全腦缺血動物模型。2.在大鼠恢復自主循環(huán)后,隨機分組為常溫治療(37±1℃)和亞低溫治療(33±1℃)。亞低溫治療根據(jù)治療的起始時間分為0,1,4或8小時后治療組,亞低溫維持24或48小時。3.復蘇后連續(xù)7天觀察大鼠的生存狀態(tài),應用Kaplan-Meier分析,比較各組的生存率。4.將存活7天評分大于等于450分定為神經功能良好,通過卡方檢驗比較組間差異。5.灌注存活7天的大鼠取腦,切片后行Hoechst和NeuN雙染色,在熒光顯微鏡下用立體體視學技術對大鼠海馬CA1區(qū)存活的正常形態(tài)神經元進行計數(shù),用方差分析將各組平均值進行比較。6.在雄性成年Long Evans大鼠體內海馬CA1區(qū)原位進行RNA干擾轉染,降低μ-calpain和m-calpain表達。7.經過6分鐘短暫前腦缺血(TFI)再灌注,分別在72小時和2周取腦,進行切片和免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察降低μ-calpain和m-calpain表達缺血再灌注損傷后神經元的存活。8.采用原代培養(yǎng)神經元,在NDMA介質中模擬缺血再灌注過程,觀察亞低溫結合鎂離子聯(lián)合作用下神經元的存活。9.在10min窒息心臟停跳心肺復蘇全腦缺血動物模型中應用亞低溫聯(lián)合靜脈輸入硫酸鎂治療,觀察對海馬CA1神經元存活的影響。結果:1.經10min窒息心臟停跳心肺復蘇全腦缺血動物大鼠,常溫治療組7天存活率為17%,亞低溫治療起始于0,1,4和8小時后的7天存活率分別為45%,36%,36%和14%,起始于0,1和4小時的亞低溫治療相對于常溫治療顯著地提高了生存率(P0.05)。2.亞低溫治療維持24或48小時的生存率沒有統(tǒng)計學差異。3.亞低溫治療維持24或48小時對改善神經功能沒有統(tǒng)計學差異(均為17%)。4.起始時間為0,1,4和8小時的亞低溫治療有良好神經功能的分別為24%,24%,19%,0%。與常溫治療組相比較,亞低溫治療起始于0,1和4小時組分別顯著改善了神經功能(P0.01),三組之間沒有統(tǒng)計學差異。5.以假手術組平均神經元數(shù)為參照,亞低溫治療起始于0,1,4和8小時的CA1區(qū)正常神經元分別為53%,53%,51%和65%,相對于僅存9%正常神經元的常溫治療組,神經元數(shù)顯著增加(P0.0001)。6.相對于保存了42%正常神經元數(shù)量的24小時亞低溫治療,保存了68%正常神經元數(shù)量的48小時亞低溫治療保護了更多的神經元(P0.0001)。7.海馬CA1區(qū)μ-calpain shRNA原位轉染,在全腦缺血再灌注后,μ-calpain shRNA組神經元存活率顯著提高(P0.05)。8.體外模擬缺血再灌注,亞低溫與高濃度鎂離子結合的治療方案顯著地保護了神經元(P0.05)。9.在小樣本量的10min窒息心臟停跳心肺復蘇全腦缺血動物大鼠模型,亞低溫結合鎂離子治療保護了60.95%的海馬CA1區(qū)神經元,而單純亞低溫治療保護了44.75%的海馬CA1區(qū)神經元,兩組差別沒有統(tǒng)計學意義(P=0.34)。結論:1.對心臟停跳復蘇后的全腦缺血再灌注大鼠模型進行亞低溫治療,起始于0、1、4小時,以及持續(xù)治療24和48小時的亞低溫治療均顯著提高生存率。亞低溫治療起始于0、1、4和8小時,以及持續(xù)治療24和48小時均顯著增加海馬CA1區(qū)存活的神經元數(shù)量,且持續(xù)治療48小時的亞低溫治療增加神經元存活數(shù)量的作用更明顯。2.對海馬CA1神經元進行capn1 shRNA處理,能夠降低短暫前腦缺血再灌注72小時后calpain的表達,并能夠顯著提高前腦缺血再灌注2周后大鼠海馬CA1神經元的存活率。3.體外和在體研究顯示,與亞低溫治療組相比,亞低溫治療與硫酸鎂聯(lián)合應用具有增加缺血再灌注后神經元存活的趨勢,但在體內研究中無統(tǒng)計學差異。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R743

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本文編號：2683181