【摘要】：目的:全腦的缺血再灌注損傷是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)急癥。以心臟停跳復(fù)蘇后的全腦缺血再灌注為例,全腦的缺血再灌注損傷患者的最終存活率大約只有12%,存活者中具有良好神經(jīng)功能的患者少于5%。亞低溫治療是目前唯一在臨床上被證實(shí)的在心臟停跳恢復(fù)自主循環(huán)后能有效提高生存率和改善神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后的治療方式。但是在亞低溫治療中,亞低溫起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的選擇對(duì)于提高治療效果十分重要,明確最佳亞低溫起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間的作用與機(jī)制意義重大。Calpain是非溶酶體中性半胱氨酸蛋白水解酶家族中的成員,其活動(dòng)依賴于鈣,并受特異性內(nèi)源性抑制物鈣蛋白酶抑素的調(diào)節(jié)。目前報(bào)告的calpain共有11種亞型,在腦組織中最豐富最具特征的的亞型為μ-calpain和m-calpain。Bendarski的研究表明,μ-calpain在腦缺血后calpain調(diào)節(jié)腦組織的病理生理過(guò)程中發(fā)揮主要作用。Liebetrau等人發(fā)現(xiàn),亞低溫能夠減少腦缺血再灌注后calpain的活動(dòng)及其引起的蛋白水解,這一研究提示抑制calpain的活動(dòng),能夠保護(hù)腦缺血再灌注后的神經(jīng)元。而在體內(nèi)還需要進(jìn)一步研究m-calpain和μ-calpain在腦缺血再灌注損傷的作用。鎂離子具有多種功效,它是天門冬氨酸(NMDA)受體和鈣離子的拮抗劑,又是血管擴(kuò)張劑,而且多種腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)硫酸鎂對(duì)血腦屏障還具有保護(hù)作用。Miles等人通過(guò)靜脈輸入硫酸鎂抑制了短暫前腦缺血再灌注后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡,而Zhu等人發(fā)現(xiàn)靜脈輸入硫酸鎂與亞低溫治療相結(jié)合能進(jìn)一步減少短暫全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡。但是仍需要檢驗(yàn)亞低溫治療結(jié)合靜脈輸入硫酸鎂對(duì)心跳驟停后全腦缺血再灌注的神經(jīng)保護(hù)效果,為臨床醫(yī)療提供新的思路及理論支持。研究方法:1.采用雄性成年Long Evans大鼠建立10min窒息心臟停跳心肺復(fù)蘇全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?.在大鼠恢復(fù)自主循環(huán)后,隨機(jī)分組為常溫治療(37±1℃)和亞低溫治療(33±1℃)。亞低溫治療根據(jù)治療的起始時(shí)間分為0,1,4或8小時(shí)后治療組,亞低溫維持24或48小時(shí)。3.復(fù)蘇后連續(xù)7天觀察大鼠的生存狀態(tài),應(yīng)用Kaplan-Meier分析,比較各組的生存率。4.將存活7天評(píng)分大于等于450分定為神經(jīng)功能良好,通過(guò)卡方檢驗(yàn)比較組間差異。5.灌注存活7天的大鼠取腦,切片后行Hoechst和NeuN雙染色,在熒光顯微鏡下用立體體視學(xué)技術(shù)對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)存活的正常形態(tài)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù),用方差分析將各組平均值進(jìn)行比較。6.在雄性成年Long Evans大鼠體內(nèi)海馬CA1區(qū)原位進(jìn)行RNA干擾轉(zhuǎn)染,降低μ-calpain和m-calpain表達(dá)。7.經(jīng)過(guò)6分鐘短暫前腦缺血(TFI)再灌注,分別在72小時(shí)和2周取腦,進(jìn)行切片和免疫熒光染色,熒光顯微鏡下觀察降低μ-calpain和m-calpain表達(dá)缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的存活。8.采用原代培養(yǎng)神經(jīng)元,在NDMA介質(zhì)中模擬缺血再灌注過(guò)程,觀察亞低溫結(jié)合鎂離子聯(lián)合作用下神經(jīng)元的存活。9.在10min窒息心臟停跳心肺復(fù)蘇全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭袘?yīng)用亞低溫聯(lián)合靜脈輸入硫酸鎂治療,觀察對(duì)海馬CA1神經(jīng)元存活的影響。結(jié)果:1.經(jīng)10min窒息心臟停跳心肺復(fù)蘇全腦缺血?jiǎng)游锎笫?常溫治療組7天存活率為17%,亞低溫治療起始于0,1,4和8小時(shí)后的7天存活率分別為45%,36%,36%和14%,起始于0,1和4小時(shí)的亞低溫治療相對(duì)于常溫治療顯著地提高了生存率(P0.05)。2.亞低溫治療維持24或48小時(shí)的生存率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.亞低溫治療維持24或48小時(shí)對(duì)改善神經(jīng)功能沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為17%)。4.起始時(shí)間為0,1,4和8小時(shí)的亞低溫治療有良好神經(jīng)功能的分別為24%,24%,19%,0%。與常溫治療組相比較,亞低溫治療起始于0,1和4小時(shí)組分別顯著改善了神經(jīng)功能(P0.01),三組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.以假手術(shù)組平均神經(jīng)元數(shù)為參照,亞低溫治療起始于0,1,4和8小時(shí)的CA1區(qū)正常神經(jīng)元分別為53%,53%,51%和65%,相對(duì)于僅存9%正常神經(jīng)元的常溫治療組,神經(jīng)元數(shù)顯著增加(P0.0001)。6.相對(duì)于保存了42%正常神經(jīng)元數(shù)量的24小時(shí)亞低溫治療,保存了68%正常神經(jīng)元數(shù)量的48小時(shí)亞低溫治療保護(hù)了更多的神經(jīng)元(P0.0001)。7.海馬CA1區(qū)μ-calpain shRNA原位轉(zhuǎn)染,在全腦缺血再灌注后,μ-calpain shRNA組神經(jīng)元存活率顯著提高(P0.05)。8.體外模擬缺血再灌注,亞低溫與高濃度鎂離子結(jié)合的治療方案顯著地保護(hù)了神經(jīng)元(P0.05)。9.在小樣本量的10min窒息心臟停跳心肺復(fù)蘇全腦缺血?jiǎng)游锎笫竽Ｐ?亞低溫結(jié)合鎂離子治療保護(hù)了60.95%的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元,而單純亞低溫治療保護(hù)了44.75%的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元,兩組差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.34)。結(jié)論:1.對(duì)心臟停跳復(fù)蘇后的全腦缺血再灌注大鼠模型進(jìn)行亞低溫治療,起始于0、1、4小時(shí),以及持續(xù)治療24和48小時(shí)的亞低溫治療均顯著提高生存率。亞低溫治療起始于0、1、4和8小時(shí),以及持續(xù)治療24和48小時(shí)均顯著增加海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量,且持續(xù)治療48小時(shí)的亞低溫治療增加神經(jīng)元存活數(shù)量的作用更明顯。2.對(duì)海馬CA1神經(jīng)元進(jìn)行capn1 shRNA處理,能夠降低短暫前腦缺血再灌注72小時(shí)后calpain的表達(dá),并能夠顯著提高前腦缺血再灌注2周后大鼠海馬CA1神經(jīng)元的存活率。3.體外和在體研究顯示,與亞低溫治療組相比,亞低溫治療與硫酸鎂聯(lián)合應(yīng)用具有增加缺血再灌注后神經(jīng)元存活的趨勢(shì),但在體內(nèi)研究中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2683181