【摘要】：背景與目的腦膠質(zhì)瘤是目前人類腫瘤中最為常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,約占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%~40%,是生存時間最短及預(yù)后最差的疾病類型之一。隨著社會的發(fā)展,腫瘤已經(jīng)成為人類較為常見的疾病,腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病位居第二,是目前威脅人類健康最重要的疾病之一。盡管近年來隨著醫(yī)療水平的發(fā)展,手術(shù)治療、放射治療及藥物化療等常規(guī)治療手段取得了較大的進(jìn)步,但由于腦膠質(zhì)瘤浸潤生長的特性,導(dǎo)致腫瘤部位難以徹底切除而復(fù)發(fā),影響腦膠質(zhì)瘤治療的預(yù)后,且目前診療腦膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)記物仍然非常有限。近年來,隨著分子生物學(xué)認(rèn)識的不斷深入,分子靶向逐漸成為治療腫瘤新的治療措施,其成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)治療的重要組成部分。人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3(human mitochondrial transcription termination factor 3,hMTERF3)是一個負(fù)調(diào)控線粒體基因表達(dá)和氧化磷酸化活性的蛋白質(zhì)。已有研究報道,hMTERF3基因拷貝數(shù)擴(kuò)增及其過表達(dá)對肝細(xì)胞癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后有重要作用,但目前,關(guān)于hMTERF3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其預(yù)后意義尚未見相關(guān)報道。本課題首先基于TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘并分析hMTERF3的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系,探討hMTERF3表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性。通過免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察hMTERF3蛋白在腦膠質(zhì)瘤和非腫瘤性腦組織中的表達(dá)。構(gòu)建及鑒定重組真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3,并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測hMTERF3蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-hMTERF3對腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的線粒體DNA拷貝數(shù)、線粒體蛋白表達(dá)水平及其細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等生物學(xué)行為的影響。本研究將為闡明hMTERF3在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定實驗基礎(chǔ),也為腦膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供潛在的分子靶標(biāo)。方法利用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)于hMTERF3基因的信息,并對hMTERF3基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)進(jìn)行薈萃分析;利用Bioconductor/TCGA biolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)下載臨床資料數(shù)據(jù),使用R3.3.0軟件對TCGA數(shù)據(jù)庫中526例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理參數(shù)與hMTERF3表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。使用Graphpad 5.0軟件對TCGA數(shù)據(jù)集中高表達(dá)hMTERF3和低表達(dá)hMTERF3的腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后生存進(jìn)行Kaplan-Meier分析。同時,在大理州人民醫(yī)院收集2008~2012年的20例腦膠質(zhì)瘤組織及16例非腫瘤性腦組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化。20例腦膠質(zhì)瘤患者中男性13例,女性7例,年齡14~62歲,均為首次確診,手術(shù)前未經(jīng)化療、放療。采用免疫組織化學(xué)方法檢測上述標(biāo)本中hMTERF3蛋白的表達(dá)情況,并比較其表達(dá)水平的差異;根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因序列設(shè)計引物,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從pGEM-hMTERF3重組克隆載體中擴(kuò)增出hMTERF3基因開放閱讀框序列,經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后,連接入真核表達(dá)載體p3×FLAG-CMV-14的多克隆位點(diǎn)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3,分別用菌落PCR、限制性核酸內(nèi)切酶和DNA序列分析3種方法鑒定重組子;利用不同的生物信息學(xué)軟件對hMTERF3蛋白進(jìn)行系統(tǒng)研究,包括hMTERF3的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)功能域、亞細(xì)胞定位、同源蛋白多重序列比對、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及三級結(jié)構(gòu)同源建模;采用半定量PCR和Western blot檢測過表達(dá)hMTERF3對腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞線粒體DNA拷貝量變化、線粒體編碼蛋白的表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞術(shù)和MTT法檢測過表達(dá)hMTERF3對細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果1、利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),hMTERF3在腦膠質(zhì)瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)庫中下載得到526例腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理資料,通過使用R軟件分析結(jié)果顯示,hMTERF3的表達(dá)與年齡(P=0.010)、腫瘤原發(fā)部位(P=0.048)、幕上定位(P=0.041)、等級(P0.001)及病理類型(P0.001)明顯相關(guān)。而與性別、發(fā)病部位、頭痛史、樣本類型無關(guān)(均P0.05)。進(jìn)一步利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析hMTERF3表達(dá)對腦膠質(zhì)瘤患者生存時間的影響發(fā)現(xiàn),hMTERF3高表達(dá)組的OS(P=0.001,HR=2.03)及DFS(P=0.004,HR=1.54)均低于hMTERF3低表達(dá)組,兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。多因素分析結(jié)果顯示,年齡、腫瘤原發(fā)部位等均是影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素(P0.05)。免疫組化分析表明,hMTERF3蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),而在非腫瘤性腦組織中低表達(dá),在腦膠質(zhì)瘤組織中hMTERF3蛋白的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)中,呈淺黃色或棕黃色染色。其中腦膠質(zhì)瘤組織中hMTERF3蛋白的陽性表達(dá)較強(qiáng),染色較深,而在非腫瘤性腦組織中也可觀察到hMTERF3蛋白的表達(dá),但染色較淺。2、利用不同的生物信息學(xué)軟件對hMTERF3蛋白進(jìn)行系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn),hMTERF3蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲,同時包含6個MTERF基序,三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,該蛋白定位于人線粒體內(nèi);同源蛋白多重序列比對和進(jìn)化分析顯示,該蛋白與大鼠、小鼠等哺乳動物的MTERF3蛋白具有高度的同源性,且親緣關(guān)系更近。重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-hMTERF3經(jīng)雙酶切鑒定和菌落PCR鑒定均獲得大小為1254bp的目的條帶,DNA序列分析結(jié)果表明該序列與GenBank中hMTERF3基因序列的同源性達(dá)到100%,插入基因的大小和方向均正確。3、轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞后通過半定量PCR檢測線粒體DNA拷貝量發(fā)現(xiàn),過表達(dá)hMTERF3對線粒體DNA的復(fù)制起顯著抑制作用;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)hMTERF3過強(qiáng)表達(dá)會降低線粒體編碼的ND1蛋白水平;MTT檢測結(jié)果顯示,過表達(dá)hMTERF3促進(jìn)U251細(xì)胞的增殖;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),hMTERF3過強(qiáng)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖,并導(dǎo)致細(xì)胞順利通過G1/S控制點(diǎn),細(xì)胞周期未出現(xiàn)阻滯和凋亡。結(jié)論1、研究表明,基于TCGA和Oncomine數(shù)據(jù)庫獲取腦膠質(zhì)瘤組織中hMTERF3表達(dá)的相關(guān)信息,為深入研究hMTERF3在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。免疫組化檢測hMTERF3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)增高,提示hMTERF3可能參與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,并且可能與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。2、成功構(gòu)建hMTERF3基因的真核表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究hMTERF3基因在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ);利用不同的生物信息學(xué)軟件分析該蛋白的結(jié)構(gòu),這為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。3、在腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中過表達(dá)hMTERF3顯著抑制線粒體DNA的復(fù)制水平,并且影響線粒體編碼ND1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。同時過表達(dá)hMTERF3能顯著促進(jìn)U251細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞周期G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)變進(jìn)程,并且不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

鏈和輕鏈復(fù)制起點(diǎn)（箭頭表示方向），黃色方框表A 和編碼蛋白的基因。圖 1-1. 人線粒體 DNA 結(jié)構(gòu)圖 為雙鏈閉合環(huán)狀，，外環(huán)稱重鏈(H)，內(nèi)環(huán)稱于兩條鏈所含有的核苷酸不同所引起的，重A 分子量較大，而輕鏈胞嘧啶所占比重較多編碼氧化磷酸化呼吸鏈復(fù)合體亞基上的 12 種，而輕鏈只編碼氧化磷酸化呼吸鏈復(fù)合體亞NA。線粒體 DNA 上的基因排列非常緊湊，一小段 D 環(huán)區(qū)(displacement loop)無基因編碼含有線粒體 DNA 復(fù)制及轉(zhuǎn)錄所需要的調(diào)控序uence box, CSB)、復(fù)制相關(guān)的終止結(jié)合序列（和線粒體 DNA 轉(zhuǎn)錄的啟動子序列[12,13]。線，重鏈上 2 個(HSP1,HSP2)及輕鏈上 1 個(LS

高遷移蛋白家族(HMG)。在線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和揮重要的作用[28,29]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子B(TFB1M,TFB2M)重要調(diào)控因子，由核基因編碼通過特殊的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線TFB2M與線粒體RNA聚合酶（POLRMT）形成異源二啟動子開始轉(zhuǎn)錄[30]。轉(zhuǎn)錄終止因子(mitochondrial transcription termination fact因編碼通過特殊的方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，并能與mtDNA在線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯中發(fā)揮調(diào)控作用[發(fā)現(xiàn)，線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族有4個成員(MTETERF2僅存在于脊柱動物中，而MTERF3和MTERF4在都存在，并且它們之間都含有亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)和與m蛋白家族主要的特征是：定位于線粒體和存在不定重復(fù)數(shù)氨基酸折疊而成的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)）。
【學(xué)位授予單位】：大理大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張宇;程松;王凌青;周安海;;腦膠質(zhì)瘤中基因表達(dá)情況及診斷的研究[J];實用癌癥雜志;2018年08期

2 王超;劉建雄;;外泌體在腦膠質(zhì)瘤診斷與治療的研究進(jìn)展[J];中國微侵襲神經(jīng)外科雜志;2017年02期

3 吳鐳;;中國學(xué)者在腦膠質(zhì)瘤術(shù)后化療研究方面取得重要進(jìn)展[J];中國科學(xué)基金;2017年05期

4 張國榮;;復(fù)發(fā)腦膠質(zhì)瘤的影像診斷與治療進(jìn)展[J];立體定向和功能性神經(jīng)外科雜志;2015年01期

5 程敬亮;楊濤;;磁共振成像在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用及進(jìn)展[J];磁共振成像;2014年S1期

6 王翔;叢琳;劉效輝;杜怡峰;;腦膠質(zhì)瘤病的臨床、影像及病理特點(diǎn)(附1例報告及文獻(xiàn)回顧)[J];北京醫(yī)學(xué);2015年05期

7 錢海鵬;;什么是腦膠質(zhì)瘤?[J];抗癌之窗;2016年06期

8 趙寒;;腦膠質(zhì)瘤不等于死亡通知書——訪哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)外科主任梁鵬教授[J];科學(xué)養(yǎng)生;2017年05期

9 梁鵬;;腦膠質(zhì)瘤不等于死亡通知書[J];健康生活;2017年07期

10 譚敦民;;腦膠質(zhì)瘤≠死亡通知書[J];保健醫(yī)苑;2017年09期

相關(guān)會議論文 前10條

1 王翔;叢琳;劉效輝;杜怡峰;;表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙的腦膠質(zhì)瘤病1例報告及文獻(xiàn)回顧[A];第四屆全國癡呆與認(rèn)知障礙學(xué)術(shù)研討會及高級講授班論文匯編[C];2015年

2 王翔;叢琳;劉效輝;杜怡峰;;表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙的腦膠質(zhì)瘤病1例報告及文獻(xiàn)回顧[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編（下）[C];2015年

3 付學(xué)海;石梅;肖鋒;;分次伽馬刀治療腦膠質(zhì)瘤的療效分析[A];中華醫(yī)學(xué)會放射腫瘤治療學(xué)分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

4 張賀;楊廷艦;宋浩青;丁曉東;劉冰;劉偉;;腦膠質(zhì)瘤治療體會(摘要)[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

5 傅相平;李安民;;腦膠質(zhì)瘤瘤區(qū)化療的臨床研究[A];中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

6 殷增進(jìn);;腦膠質(zhì)瘤伽馬刀治療臨床分析[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第六屆全國代表大會論文匯編[C];2011年

7 李文斌;陳慧媛;康勛;;腦膠質(zhì)瘤的免疫治療[A];第十三屆中國科協(xié)年會第18分會場-癌癥流行病趨勢和防控策略研討會論文集[C];2011年

8 劉毅;;腦膠質(zhì)瘤術(shù)后放化療觀察[A];中國腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

9 汪志明;陳淑珍;王林;;中西醫(yī)結(jié)合治療腦膠質(zhì)瘤24例報道[A];第八屆全國中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)術(shù)會議論文集[C];2000年

10 傅相平;李安民;張志文;查椺光;易林華;劉愛軍;杜程剛;趙明;;腦膠質(zhì)瘤單抗~(131)Ⅰ瘤內(nèi)放免治療研究(附56例報告)[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第二屆全國代表大會論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 通訊員 唐文佳;腦膠質(zhì)瘤到底是什么樣的惡性腫瘤[N];家庭醫(yī)生報;2018年

2 通訊員 羅聞 汪泉Oz 黃正;中南六省(區(qū))成立聯(lián)盟對抗高死亡率腦膠質(zhì)瘤[N];大眾衛(wèi)生報;2017年

3 美國麻省總醫(yī)院(MGH)神經(jīng)外科教授 卡特 整理 朱永基;腦膠質(zhì)瘤并非不治之癥[N];健康報;2017年

4 天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腦系腫瘤科教授 李文良;治腦膠質(zhì)瘤 防復(fù)發(fā)是關(guān)鍵[N];健康報;2017年

5 鄒爭春 朱廣平;腦膠質(zhì)瘤診斷有望從“有創(chuàng)”到“無創(chuàng)”[N];中國醫(yī)藥報;2013年

6 記者 宜秀萍;蘭大二院腦膠質(zhì)瘤研究通過省級鑒定[N];甘肅日報;2011年

7 本報記者 王雪敏;綜合治療腦膠質(zhì)瘤[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2010年

8 通訊員 張獻(xiàn)懷;腦膠質(zhì)瘤臨床研究與治療獲新進(jìn)展[N];大眾科技報;2009年

9 匡遠(yuǎn)深;早期評估腦膠質(zhì)瘤的放療療效有新方法[N];中國醫(yī)藥報;2009年

10 楊霞;光敏分子激光靶向治療腦膠質(zhì)瘤[N];中國醫(yī)藥報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅子淼;智能靶向遞藥系統(tǒng)用于腦膠質(zhì)瘤的治療[D];華東師范大學(xué);2018年

2 程霄;泛素連接酶NEDD4-1基因?qū)δX膠質(zhì)瘤侵襲和增殖作用的MRI評價[D];鄭州大學(xué);2018年

3 張列祥;miRNA-375對腦膠質(zhì)瘤增殖和凋亡的作用與機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2018年

4 趙永;SHP-2激活突變促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及侵襲性的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2018年

5 景世元;長鏈非編碼RNA CRNDE對腦膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制及預(yù)后分析[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

6 胡火軍;白藜蘆醇抗人腦膠質(zhì)瘤作用及機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2014年

7 王朝艷;3.0T磁共振多模態(tài)影像對腦膠質(zhì)瘤診斷價值與病理對照相關(guān)性研究[D];鄭州大學(xué);2017年

8 劉希堯;MicroRNA-105通過靶向調(diào)控SOX9的表達(dá)抑制腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

9 楊佳丹;轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合肽與超聲微泡聯(lián)合介導(dǎo)抗腫瘤藥物治療腦膠質(zhì)瘤的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

10 杜渭清;磁共振灌注成像在腦膠質(zhì)瘤的臨床應(yīng)用及動物實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張強(qiáng);超聲輔助Angiopep-2修飾的還原響應(yīng)性膠束治療腦膠質(zhì)瘤的實驗研究[D];陜西師范大學(xué);2018年

2 王曉婭;基于影像組學(xué)的腦膠質(zhì)瘤分級預(yù)測研究[D];山東大學(xué);2018年

3 任飛飛;腦膠質(zhì)瘤中IDH1-R132H型突變對NK細(xì)胞抗腫瘤作用影響的研究[D];鄭州大學(xué);2018年

4 董英英;白細(xì)胞介素-8在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2018年

5 張瑩瑩;NGFR/NF-κB/Nav1.5在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2018年

6 朱明婷;轉(zhuǎn)鐵蛋白共載吲哚菁綠納米探針用于腦膠質(zhì)瘤雙模態(tài)成像和光熱治療的研究[D];陜西師范大學(xué);2018年

7 孫美濤;人MTERF3在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)及其對腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響[D];大理大學(xué);2018年

8 蔣海璐;Pirin對腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖和自我更新的作用研究[D];軍事科學(xué)院;2018年

9 紀(jì)晨星;MicroRNA-375調(diào)控RWDD3對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及遷移功能的研究[D];南昌大學(xué);2018年

10 艾師戎;~1H-MRS在腦膠質(zhì)瘤診斷及分級中的應(yīng)用價值[D];錦州醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2681608