【摘要】：帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的、與衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD主要的病理特征是中腦黑質(zhì)(Substantia nigra,SN)致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神經(jīng)元進(jìn)行性退變壞死,引起紋狀體部位DA含量下降。目前臨床治療PD的方法主要包括藥物治療和手術(shù)治療,但這些治療手段只能緩解癥狀,仍不能有效改變由于神經(jīng)元進(jìn)行性退變死亡引起的系統(tǒng)功能障礙。因此尋求理想的治療手段以補(bǔ)充缺失DA能神經(jīng)元迫在眉睫。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一類具有高度自我更新能力的細(xì)胞。NSCs在增殖和遷移的過程中具有多向分化潛能,可以分化為DA能神經(jīng)元,被譽(yù)為是治療PD最具有應(yīng)用前景的種子細(xì)胞。然而,目前常規(guī)誘導(dǎo)NSCs向DA能神經(jīng)元分化方案效率較低、步驟繁瑣而且不穩(wěn)定,故很大程度限制了其在PD治療中的應(yīng)用。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)是傳統(tǒng)中藥何首烏(Polygonum multiflorum thunb,PM)的主要活性成分,大量研究表明TSG具有促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌和神經(jīng)保護(hù)作用,但TSG能否有效誘導(dǎo)NSCs向DA能神經(jīng)元方向分化的作用尚不清楚。本課題以小鼠中腦腹側(cè)NSCs為切入點(diǎn),觀察了TSG誘導(dǎo)中腦NSCs定向分化為DA能神經(jīng)元的作用,采用細(xì)胞和分子生物學(xué)等技術(shù),從形態(tài)特征和生化表型對(duì)分化產(chǎn)生的DA能神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。目前誘導(dǎo)NSCs定向分化機(jī)制尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)將探明TSG促進(jìn)NSCs分化為DA能神經(jīng)元的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路,為臨床治療PD等神經(jīng)退變性疾病的中藥聯(lián)合細(xì)胞治療及組織工程提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【目的】1.探討中藥何首烏活性成分TSG誘導(dǎo)NSCs定向分化為DA能神經(jīng)元的作用,獲得有生化表型和有細(xì)胞功能的成熟DA能神經(jīng)元。2.闡明TSG誘導(dǎo)NSCs定向分化為功能性DA能神經(jīng)元Wnt/β-catenin分子調(diào)控機(jī)制�！痉椒ā�1.中腦NSCs分離、培養(yǎng)和鑒定:取孕12d的Balb/c小鼠胚胎中腦腹側(cè)組織,體外分離和DMEM/F12無血清(含有20ng/ml的EGF和FGF,1%N2)培養(yǎng),細(xì)胞Nestin免疫熒光染色鑒定。2.EdU標(biāo)記:EdU標(biāo)記檢測NSCs增殖情況。3.TSG處理:去除生長因子刺激,將不同濃度的TSG(0,0.5,1,5,10,20μM)添加到培養(yǎng)基里進(jìn)行NSCs分化誘導(dǎo)。4.流式細(xì)胞檢測:檢測TSG對(duì)NSCs的作用。5.免疫熒光染色:在不同條件誘導(dǎo)后,進(jìn)行Tuj-1、GFAP、CNPase、TH、DAT、和Nurr1等的染色并觀察細(xì)胞染色情況以及細(xì)胞形態(tài)變化情況。6.Western Blot:定量分析Tuj-1、GFAP、CNPase、TH、DAT、Nurr1、Wnt1,Wnt3a,Wnt5a和β-catenin等蛋白的表達(dá)水平,比較不同誘導(dǎo)條件下這些分子表達(dá)變化�！窘Y(jié)果】第一部分:中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、增殖和細(xì)胞分化的研究1.細(xì)胞培養(yǎng)7d后可形成呈懸浮生長的“神經(jīng)球”,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長神經(jīng)球不斷增多,體積也逐漸增大,經(jīng)Nestin免疫熒光染色顯示均呈陽性,證明培養(yǎng)的細(xì)胞為NSCs。2.EdU染色結(jié)果:隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,EdU陽性細(xì)胞數(shù)量在不斷增加,5d EdU陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高。3.免疫熒光染色結(jié)果顯示:采用常規(guī)含2%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)誘導(dǎo)方案對(duì)培養(yǎng)的NSCs進(jìn)行誘導(dǎo),12h后細(xì)胞形態(tài)由球形逐漸變成多角形,并且有突起延伸,7d后,視野里細(xì)胞呈現(xiàn)不同形態(tài),有些胞體立體感強(qiáng),有的折光性好,有的細(xì)胞呈扁平形。經(jīng)Tuj-1、GFAP和CNPase免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),這些分化的細(xì)胞中,GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量最多,Tuj-1次之,CNPase陽性細(xì)胞最少,表明所培養(yǎng)的NSCs具有多分化潛能。而無血清對(duì)照組細(xì)胞貼壁速度較慢,沒有明顯的Tuj-1、CNPase、GFAP陽性細(xì)胞出現(xiàn),視野里大部分細(xì)胞呈現(xiàn)退化狀態(tài)。4.采用2%FBS誘導(dǎo)中腦NSCs分化,我們可以觀察到Tuj-1和GFAP陽性反應(yīng)細(xì)胞,隨著分化時(shí)間的延長,Tuj-1陽性細(xì)胞數(shù)目不斷增加,誘導(dǎo)分化2w后達(dá)到最高值,但是GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目一直升高。第二部分:二苯乙烯苷對(duì)中腦神經(jīng)干細(xì)胞存活、凋亡和分化的作用,及其相關(guān)的Wnt/β-catenin信號(hào)分子機(jī)制1.流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明:在5個(gè)不同濃度TSG(0.5,1,5,10,20μM)誘導(dǎo)組中,TSG(1,5,10μM)組中腦NSCs存活數(shù)目較多,細(xì)胞凋亡較少,其中10μM TSG作用最佳,與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.01)。2.免疫熒光染色和Western blot檢測結(jié)果顯示:i 10μM TSG+2%FBS誘導(dǎo)NSCs分化2w,在分化細(xì)胞中,Tuj-1陽性細(xì)胞數(shù)目和蛋白表達(dá)相對(duì)于2%FBS對(duì)照組明顯增加,而GFAP和CNPase陽性細(xì)胞數(shù)目和蛋白表達(dá)減少,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(P0.01)。10μM TSG組作用與10μM TSG+2%FBS組在促NSCs分化效果相似。而空白對(duì)照組(不加任何誘導(dǎo)劑),沒有明顯的細(xì)胞分化,未檢測到Tuj-1、GFAP和CNPase陽性細(xì)胞及蛋白表達(dá)。ii在對(duì)DA能神經(jīng)元三個(gè)特異性標(biāo)記蛋白檢測中,研究發(fā)現(xiàn)10μM TSG+2%FBS誘導(dǎo)NSCs分化2w,分化的細(xì)胞中TH、DAT和Nurr1陽性細(xì)胞數(shù)目和蛋白表達(dá)水平增加,單獨(dú)TSG作用與TSG+2%FBS組效果相似,這兩組與2%FBS組相比都有顯著性差異(P0.01),而空白對(duì)照組(沒有任何誘導(dǎo)劑)沒有明顯的陽性細(xì)胞出現(xiàn)和蛋白表達(dá)。3.TSG誘導(dǎo)NSCs分化的機(jī)制:Western blot檢測結(jié)果表明:同樣地,在以上相同的處理組中,10μM TSG+2%FBS誘導(dǎo)可明顯的提高分化的細(xì)胞中Wnt1、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)水平,單獨(dú)TSG作用與TSG+2%FBS組效果相似,這兩組與2%FBS組相比都有顯著性差異(P0.01)。而空白對(duì)照組(不加任何誘導(dǎo)劑),沒有明顯的細(xì)胞分化,未檢測到Wnt1、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)。而給予Wnt信號(hào)阻斷劑IWR1處理,倒置相差顯微鏡下觀察可以看到NSCs增殖速度明顯升高,細(xì)胞遷移和分化能力明顯降低。流式細(xì)胞檢測顯示:加入IWR1阻斷劑明顯抑制NSCs的存活,表現(xiàn)為細(xì)胞存活數(shù)目降低,凋亡數(shù)目增加,與未加入IWR1阻斷劑的10μM TSG組相比有顯著性差異(P0.01)。此外,免疫熒光染色結(jié)果表明:IWR1阻斷劑組分化的細(xì)胞中Tuj-1和TH雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯少于未加入IWR1阻斷劑10μM TSG組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示有顯著性差異(P0.01)。【結(jié)論】1.采用常規(guī)的含2%FBS培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)NSCs可分化為三種細(xì)胞類型:神經(jīng)元(Tuj-1~+)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP~+)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(CNPase~+)。NSCs向神經(jīng)元方向分化的最佳時(shí)間為2w。而無血清誘導(dǎo)條件的細(xì)胞不能正常分化,呈現(xiàn)退化狀態(tài)。2.一定濃度的TSG可以促進(jìn)中腦NSCs存活,減少細(xì)胞凋亡,10μM TSG作用效果最佳。另一方面,與2%FBS對(duì)照組相比,TSG可以促進(jìn)NSCs分化為更多的DA能神經(jīng)元,且能夠表達(dá)DA能神經(jīng)元TH、DAT和Nurr1等標(biāo)志性markers,表明NSCs分化產(chǎn)生的細(xì)胞具有成熟DA能神經(jīng)元的形態(tài)特征。3.TSG誘導(dǎo)中腦NSCs定向分化為DA能神經(jīng)元作用機(jī)制可能是通過激活Wnt/β-catenin分子信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2681325