【摘要】：目的:相關(guān)研究證實,外泌體參與細胞間通訊并調(diào)控靶細胞的相關(guān)行為。數(shù)據(jù)表明,腦微血管內(nèi)皮細胞可分泌外泌體。因此,本研究旨在進一步探討內(nèi)皮細胞外泌體對神經(jīng)祖細胞生存活性的影響,并在MCAO模型中進一步驗證,從而為卒中后損傷區(qū)神經(jīng)功能重建提供新的思路及潛在的臨床治療手段。方法:1.分離培養(yǎng)野生型小鼠的神經(jīng)祖細胞(NPC),用干細胞專用培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng),待純化后利用免疫熒光法鑒定其表面特異性抗原。2.用超速離心的方法提取鼠源微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3)的外泌體,并通過透射電鏡,Western blot,動態(tài)光散射進行鑒定,分別使用不同濃度培養(yǎng)NPCs,利用CCK8試劑,Edu試劑盒檢測其對NPCs增殖能力的影響;利用Trans-well,細胞劃痕實驗檢測外泌體對NPCs遷移能力的作用;在營養(yǎng)因子剝奪的環(huán)境中,外泌體處理3h通過FACS/PI檢測其對NPCs細胞凋亡的影響,采用Western blot進一步檢測各類凋亡蛋白的表達情況。3.MCAO造模成功后,通過顱內(nèi)立體定位儀在側(cè)腦室注射100uL,100ug/mL的外泌體或PBS,分別在第1,3,7,14,21天進行行為學(xué)的評定,第1天和21天通過顱腦磁共振檢測動物的病變情況,并分別統(tǒng)計腦梗死體積。結(jié)果:神經(jīng)祖細胞特異性抗體Sox2、Nestin雙標(biāo)成功鑒定提取的細胞;通過Edu,Dapi染色證明了內(nèi)皮細胞可促進神經(jīng)祖細胞的增殖和遷移,且與內(nèi)皮細胞的數(shù)量成正比。透射電鏡下外泌體形態(tài)為橢圓形或圓形,直徑大小為30-150nm。Western Blot檢測顯示內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液和外泌體TSG101、Alix、Flotillin-2蛋白均表達陽性。動態(tài)光散射分析分離所得細胞外囊泡大小分布均在30-200nm范圍內(nèi)。在加入的外泌體濃度為60ug/mL的條件培養(yǎng)基中,明顯能促進NPCs的增殖和遷移,并抑制其凋亡。通過TTC染色確定MCAO模型構(gòu)建成功,磁共振結(jié)果顯示造模后第1天和21天顱內(nèi)立體定位注射外泌體組的動物比注射PBS組的動物腦梗死體積有所減小,catwalk評估顯示外泌體組的動物比PBS組的動物行為學(xué)結(jié)果要好。結(jié)論:內(nèi)皮細胞的外泌體具有促進神經(jīng)祖細胞的增殖和遷移,并抑制其凋亡的功能,并且在大腦中動脈閉塞模型中驗證內(nèi)皮細胞的外泌體可改善腦梗死后動物的神經(jīng)功能修復(fù),這可能是一種潛在的臨床治療手段。
【圖文】：

神經(jīng)祖細胞細胞球經(jīng)過消化后，鋪板于經(jīng)過1% PDL 包被過的載玻片上，待其貼壁培養(yǎng)15 min后，經(jīng)過4%PFA室溫孵育細胞固定后，進行神經(jīng)祖細胞標(biāo)志物Sox2和Nestin的細胞免疫熒光染色，在普通的熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況。圖1（A-D）分別為Nestin、DAPI、Sox2及三者共染的熒光圖片。經(jīng)統(tǒng)計分析后得出，，Sox2的陽性率為98.28%±1.69%，Nestin 的陽性率為98.86%±2.16%并且Nestin和Sox2共標(biāo)的細胞陽性率為98.28%±1.69%。根據(jù)相關(guān)報道的鼠源神經(jīng)祖細胞的數(shù)據(jù)顯示，本實驗提取、培養(yǎng)的原代鼠源神經(jīng)祖細胞的純度比較高且符合使用標(biāo)準。圖1：鼠源神經(jīng)祖細胞的鑒定。A 為免疫熒光顯示Nestin（紅色）染色陽性細胞，B所示 DAPI為細胞核染色陽性標(biāo)志物，C所示為 Sox2（綠色）染色陽性細胞，所有圖片標(biāo)尺均為50 μm。2 腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3)促進神經(jīng)祖細胞(NPCs)的增殖和遷移利用trans-well模式進行bEnd.3細胞和NPCs的共培養(yǎng)。實驗組為bEnd.3細胞在trans-well上腔接種，NPCs接種于下腔

21值，從而得出bEnd.3細胞能夠促進NPCs增殖, 對照組和實驗組使用Edu試劑盒有顯著差異（P <0.01）。（圖2A-C）。類似地，將bEnd.3細胞接種于trans-well下腔，NPCs細胞接種于上腔，對照組則只在上腔接種NPCs，培養(yǎng)3天后，通過DAPI染色，熒光顯微鏡下隨機拍攝不同視野，經(jīng)統(tǒng)計分析得出bEnd.3細胞能顯著促進NPCs的遷移，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P <0.01）（圖2D-F）。綜上所述
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743.3

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