【摘要】：目的:在膽紅素腦病SD大鼠模型上明確焦亡是否參與膽紅素腦病的發(fā)病機(jī)制,調(diào)控焦亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)能否抑制膽紅素的神經(jīng)毒性,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,改善膽紅素腦病鼠的近、遠(yuǎn)期預(yù)后。在原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中探究膽紅素能否誘導(dǎo)焦亡關(guān)鍵蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase1)的活化,及抑制其活化對(duì)膽紅素神經(jīng)毒性的影響。方法:5日齡新生SD大鼠,經(jīng)小腦延髓池注射膽紅素溶液,建立膽紅素腦病動(dòng)物模型。隨機(jī)分為:對(duì)照組,膽紅素腦病組,溶劑組和VX-765組。從新生鼠出生第二天連續(xù)觀察其體重變化情況,于生后第5天建立膽紅素腦病動(dòng)物模型,動(dòng)態(tài)觀察建模6小時(shí)內(nèi)各組大鼠的神經(jīng)功能表現(xiàn)并評(píng)分,記錄各組大鼠的死亡率。Western blot檢測(cè)腦組織caspase1和NLRP3蛋白表達(dá),HE染色檢測(cè)腦組織病理變化,TUNEL染色檢測(cè)染色質(zhì)DNA斷裂,ELISA法檢測(cè)腦組織勻漿中炎癥因子IL-1β和IL-18的水平。各組大鼠四周齡時(shí),Carcia JH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分檢測(cè)運(yùn)動(dòng)、感覺等神經(jīng)功能損傷程度,轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)平衡能力,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大運(yùn)動(dòng)能力,水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力。原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元分為對(duì)照組、膽紅素組、VX-765組,Western blot檢測(cè)NLRP3、caspase1蛋白表達(dá),改良MTT、LDH釋放率及臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率及死亡率,ELISA法檢測(cè)原代培養(yǎng)上清IL-18水平。結(jié)果:建模7天后,膽紅素組大鼠腦組織NLRP3、caspase1的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p0.001)。VX-765干預(yù)后,活化caspase1表達(dá)較膽紅素組相比明顯降低(p0.01);HE染色細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn);大腦皮層、海馬和小腦部位染色質(zhì)DNA斷裂減少(p0.001);腦組織勻漿中炎癥因子IL-1β和IL-18釋放減少(p0.05);建模后神經(jīng)功能動(dòng)態(tài)評(píng)分好轉(zhuǎn)(p0.001);建模后體重增長(zhǎng)明顯(p0.001);死亡率減少(p0.05)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,與膽紅素組相比,VX-765干預(yù)顯著提高神經(jīng)功能評(píng)分(p0.001);提高大鼠在轉(zhuǎn)軸上停留的時(shí)間(p0.001);水迷宮中明顯縮短找到安全平臺(tái)的潛伏期(p0.001),提高安全象限中停留的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)(p0.001)。膽紅素誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元3h、6h,NLRP3、caspase1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p0.05)。VX-765干預(yù)后,活化caspase1表達(dá)與膽紅素組相比明顯降低(p0.05)。分組干預(yù)細(xì)胞24h,VX-765組的相對(duì)存活率為84.020±2.311%,高于膽紅素組(p0.05);VX-765組乳酸脫氫酶釋放率為10.780±1.577%,明顯低于膽紅素組(p0.05);VX-765組臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性率為5.580±1.234%,明顯低于膽紅素組(p0.05)。結(jié)論:焦亡參與膽紅素腦病大鼠發(fā)病機(jī)制,VX-765通過抑制caspase1活化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,提高膽紅素腦病鼠的近、遠(yuǎn)期預(yù)后。
【圖文】：

圖 1 膽紅素誘導(dǎo)大鼠腦組織 caspase1、NLRP3 蛋白表達(dá)(Western blot)Figure1. The expression of NLRP3 and caspase1 in the rat kernicterus model (Westernblot)(*p<0.05 with control group，***p<0.001 with control group，##p<0.01 versus the UCBgroup)2.1.2 Caspase1 介導(dǎo)膽紅素腦病鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷HE 染色由于大腦皮層、海馬和小腦是膽紅素神經(jīng)毒性的易感區(qū)，在建模后 7d 觀察 4組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化，VX-765 干預(yù)后該組細(xì)胞胞漿濃縮、核溶解、核固縮、核分裂都較膽紅素組明顯減輕（圖 2）。

20a 對(duì)照組 b 膽紅素組 c 溶劑組 d VX-765 組圖 2 四組大鼠腦組織切片皮層區(qū)、海馬區(qū)和小腦 HE 染色（×400）Figure 2. Images of H&E staining using light microscopy（×400）TUNEL 染色TUNEL 染色觀察膽紅素對(duì)染色質(zhì) DNA 的損傷程度。與對(duì)照組相比，在膽紅素組和溶劑組大鼠大腦皮層、海馬和小腦均有大量 TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞，，而VX-765 干預(yù)后其染色陽(yáng)性率均明顯減輕。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取 8 個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野隨機(jī)選取約 200 個(gè)細(xì)胞計(jì)算 TUNEL 染色陽(yáng)性率。結(jié)果表明，VX-765 干預(yù)組大鼠大腦皮層 TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞（10.09±0.79%）明顯低于膽紅素組（23.12±1.26%，p<0.001）和溶劑組（22.50±1.05%，p<0.001）；VX-765
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742

【參考文獻(xiàn)】

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1 李勝君;李夢(mèng)文;張燕;馮潔;華子瑜;;反式激活蛋白-NEMO結(jié)合域抑制膽紅素誘導(dǎo)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB活化[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年21期

本文編號(hào)：2674805