【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s Disease)是一種常見的中老年慢性神經(jīng)退行性疾病。青少年型帕金森綜合征(Juvenile Parkinsonism,JP)是一種非常罕見的遺傳性PD�；颊叽蠖嘤谇嗌倌陼r(shí)期發(fā)病,一般早于21歲,主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)展較為緩慢的震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等帕金森綜合征癥狀,多巴胺替代治療效果良好。目前已發(fā)現(xiàn)20余種單基因突變與JP相關(guān)。Pakin、Pink1和DJ-1基因突變可導(dǎo)致具有單純帕金森綜合征癥狀的JP,而攜帶PLA2G6、ATP13A2和DNAJC6基因突變的患者除了具有帕金森綜合征癥狀外,還可伴隨言語障礙、錐體束征和構(gòu)音障礙等不典型癥狀。RAB39B基因位于X染色體上,編碼一種囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,該基因突變可導(dǎo)致伴有認(rèn)知功能障礙的早發(fā)型PD。目前,在中國(guó)漢族人群中尚無RAB39B基因突變導(dǎo)致JP的報(bào)道。目的我們?cè)谇捌诠ぷ髦惺占?個(gè)JP家系,通過全外顯子組測(cè)序(Whole exome sequencing,WES)技術(shù),明確該家系的致病基因,了解RAB39B基因突變?cè)谥袊?guó)散發(fā)性PD人群中的流行特點(diǎn),并初步探究其在PD發(fā)病機(jī)制中的作用。方法1.本研究納入1個(gè)JP家系和505名在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的散發(fā)性PD患者。所有患者均完善相關(guān)檢查,并由兩名神經(jīng)內(nèi)科專科醫(yī)師進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查和診斷。同時(shí),納入510名性別、年齡與病例組匹配的健康對(duì)照。所有研究對(duì)象均知情同意,登記臨床資料、抽血及定期隨訪。2.對(duì)該家系的2名男性患者進(jìn)行WES,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行后期分析驗(yàn)證,明確其致病基因。3.利用Sanger測(cè)序,在家系內(nèi)所有成員進(jìn)行RAB39B基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證;在本地區(qū)散發(fā)性PD和正常人群中進(jìn)行RAB39B基因突變的篩查。4.構(gòu)建含有本研究發(fā)現(xiàn)的致病突變位點(diǎn)的真核表達(dá)載體,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、Real-time PCR、Western-blot及免疫熒光等技術(shù)來明確突變型RAB39B的表達(dá)水平及RAB39B對(duì)自噬功能和α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)的影響。結(jié)果1.該家系兩名男性患者表現(xiàn)為青少年時(shí)期出現(xiàn)的肢體震顫、行動(dòng)遲緩及肌強(qiáng)直等癥狀,伴隨不同程度的認(rèn)知功能障礙�；颊叩念^顱磁共振成像(Magneticresonance imaging,MRI)、計(jì)算機(jī)斷層掃描(Computed tomography,CT)結(jié)果顯示雙側(cè)基底節(jié)對(duì)稱性的鈣化。先證者之父及家系中女性成員均表現(xiàn)正常,符合X染色體連鎖的遺傳規(guī)律。2.根據(jù)WES結(jié)果,共篩選出31個(gè)兩名患者共同攜帶的可疑致病變異,其中RAB39B(c.536dupA)突變最有可能為致病突變。3.經(jīng)過Sanger測(cè)序驗(yàn)證,該家系中患者Ⅱ-2和Ⅲ-1為RAB39B基因c.536dupA半合子突變。先證者母親Ⅱ-3為RAB39B基因c.536dupA雜合突變。家系中其他正常成員Ⅱ-1、Ⅱ-4及Ⅱ-5不攜帶該突變。RAB39B基因c.536dupA突變與臨床表型共分離。在本地區(qū)散發(fā)性PD和正常人群中未發(fā)現(xiàn)RAB39B基因新的致病突變。4.成功構(gòu)建含有RAB39B基因(c.536dupA)突變型載體pcDNA3.1-HA-RAB39B-536。在N2a細(xì)胞模型中,突變型RAB39B的轉(zhuǎn)錄水平約為野生型RAB39B的2倍,而突變型RAB39B的蛋白水平明顯低于野生型,加入MG132后突變型RAB39B蛋白水平有所升高。5.RAB39B基因(c.536dupA)突變組的LC3BⅡ/Ⅰ值顯著低于野生組。6.RAB39B蛋白可能與α-Syn存在體內(nèi)相互作用關(guān)系。過表達(dá)野生型和突變型的RAB39B不影響內(nèi)源性α-Syn的蛋白水平,而過表達(dá)野生型的RAB39B會(huì)導(dǎo)致外源性的野生型和突變型(p.A53T)α-Syn蛋白水平升高。結(jié)論1.首次在中國(guó)漢族人群中發(fā)現(xiàn)RAB39B基因c.536dupA突變所導(dǎo)致的X染色體連鎖遺傳的JP。RAB39B基因突變不是PD常見的發(fā)病原因。2.首次發(fā)現(xiàn)RAB39B基因c.536dupA突變可導(dǎo)致患者出現(xiàn)雙側(cè)基底節(jié)區(qū)明顯的鈣化,擴(kuò)展了RAB39B基因突變所導(dǎo)致的PD的臨床表型。3.RAB39B基因c.536dupA突變型蛋白穩(wěn)定性下降,突變型蛋白可能通過泛素-蛋白酶體通路降解。4.RAB39B基因c.536dupA突變可能影響細(xì)胞的自噬水平。5.RAB39B蛋白可能與α-Syn存在體內(nèi)相互作用關(guān)系,可能參與α-Syn的穩(wěn)態(tài)水平的維持。
【圖文】：

法，我們?cè)卩嵵荽髮W(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收集了患者（先證者及先證者之舅）表現(xiàn)為青少年時(shí)帕金森綜合征癥狀，同時(shí)伴隨不同程度的認(rèn)知庭成員表現(xiàn)均正常，符合 X 染色體連鎖的遺傳共振成像(Magnetic resonance imaging, MRI)及graphy, CT)等檢查，同時(shí)有兩名神經(jīng)內(nèi)科�？漆t(yī)的 6 名成員均同意登記臨床資料、抽血及定期隨

圖 1.2 全外顯子組測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程[31]樣本檢測(cè)組 DNA 總量在 10μg 以上，濃度 50ng/μl 以上，A260/A280 的值在 1采用 Agilent Sureselect 方法制備測(cè)序文庫(kù)[32]NA 文庫(kù)準(zhǔn)備：使用 Covaris S2 超聲儀將基因組 DNA 片段化→修復(fù)→在末端已修復(fù)的 DNA 片段 3’末端加上“A”堿基→將特定的測(cè)NA 片段末端→將加上測(cè)序接頭的 DNA 片段利用 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增。均需用 Agencourt AMPure XP 磁珠純化樣本。測(cè)定 DNA 文庫(kù)濃度文庫(kù)雜交：將待雜交樣本與 SureSelect 靶向富集系統(tǒng)在液相A 的形式進(jìn)行雜交。用 Dynal 磁珠捕獲雜交的 DNA 片段。將未結(jié)合的 DNA 片段除去，，A 酶消化。PCR 擴(kuò)增捕獲的 DNA 片段并純化。檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量后上機(jī)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2674274